常用病毒载体的表征

病毒可自然感染细胞，它可将基因送入细胞核，是高效率的基因传送系统。目前正在进行的2600多项基因治疗临床试验中都离不开病毒载体，它发挥着将外源基因片段递送到人体细胞中的重要功能。

目前已有十几种病毒基因治疗产品被批准用于治疗癌症、传染病和单基因疾病基因药物的开发。常用于基因治疗的病毒载体包括慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV）、腺病毒（AdV）和转录病毒（RV）等，根据整合及感染情况的不同，适用于不同的疗法和适应症。

目前对于病毒载体产品质量的监管指南和行业标准仍然比较缺乏，我国的法规及指导原则主要有：

《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》

2020版《中国药典》“人用基因治疗制品总论”

《体内（外）基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》

《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》

尽管有相关指导原则的建议，但病毒载体结构复杂，种类繁多且生产工艺还各不相同，因此对其的质控充满挑战，在病毒载体开发过程中，还需要进行全面表征，以期获得关键质量属性。

根据相关指导原则，病毒载体需要进行质量研究的项目包括以下几个方面：

将外源基因包装到病毒颗粒中是病毒载体生产的核心技术，通过测序能够准确鉴定转入基因组的正确性，常用测序技术主要有Sanger、NGS和三代测序，需要根据检测基因组的长度和样本数量选择不同的测序方法。丹纳赫生命科学拥有自动化高通量的NGS方案，贝克曼库尔特的自动化工作站结合Echo声波移液处理工作站以及IDT的NGS文库构建试剂盒，可以快速、准确地完成NGS的样本前处理，帮助进行序列鉴定。

丹纳赫生命科学NGS解决方案

病毒载体的衣壳蛋白除赋予病毒固有的形状外，还具有病毒特异的抗原性和辅助感染的作用，影响药物效能和效价强度，需要进行深入表征。

腺相关病毒AAV的衣壳主要由VP1、VP2和VP3三种病毒蛋白组成，已有文献证明HEK 293细胞和SF9昆虫细胞两种表达系统会导致AAV衣壳蛋白产生不同的翻译后修饰，这些翻译后修饰的差异可能对rAAV受体结合、转运、表达动力学、表达耐久性、载体免疫原性等产生影响。因此，强烈建议对组成AAV的蛋白质进行完整表征，包括序列和翻译后修饰，以确保AAV产品的质量和一致性。

丹纳赫生命科学旗下SCIEX拥有完整的AAV衣壳蛋白表征方案。高分辨质谱对两种不同表达体系的AAV衣壳蛋白分子量检测，可以发现其蛋白形式的差异性。自测的样品中发现SF9中VP1和VP2的磷酸化水平升高，HEK293中VP3的乙酰化更加完全。

SCIEX X500B对两种表达系统中

AAV衣壳蛋白的分子量进行检测

再将样品酶解后通过对肽图的分析，可以进一步确认翻译后修饰以及所发生的位点。SCIEX 高分辨质谱ZenoTOFTM 7600系统独有的EAD碎裂模式，可以对在CID碎裂中容易发生中性丢失的修饰进行位点确认，提高肽图序列覆盖度。

SCIEX 高分辨质谱ZenoTOF™ 7600
肽图分析实验流程

翻译后修饰分析结果

另外，采用毛细管电泳CE-SDS的方法可以方便、快速地对AAV三种结构蛋白进行纯度分析。SCIEX的毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统配置激光诱导荧光检测器，可以对低浓度的不同血清型AAV衣壳蛋白进行三种结构蛋白的分离检测。

CE-SDS-LIF分析不同血清型的AAV衣壳蛋白

（Dr. ZICHUAN ZHANG, et al）

SCIEX PA 800 Plus制药分析系统

慢病毒的核心蛋白主要有核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白 (p17) ，衣壳蛋白(p24) 、两种薄膜糖蛋白以及其他非结构蛋白组成，其中p24 是构成慢病毒衣壳的主要结构蛋白，是常用于进行病毒滴度检测的指标。SCIEX的毛细管电泳系统还可以对慢病毒的核心蛋白进行谱图分析，用以进行慢病毒蛋白的纯度评估。通过在慢病毒样本中添加p24标准品，进行p24蛋白的鉴定以及滴度检测。

SCIEX Biophase 8800对慢病毒的蛋白谱检测

在病毒载体的工艺生产中，为了确保病毒载体在临床转化研究和试验上的功效和安全性，对空衣壳病毒颗粒和完整病毒颗粒的比率进行快速和准确的分析是十分重要的。贝克曼库尔特的分析型超速离心机Optima AUC已广泛应用于病毒载体颗粒的空壳率检测和生产过程中的定量。它能精确表征样本中各个组分的异质性、聚集体、空壳颗粒、包装部分基因组的颗粒和包装完整基因组的实心颗粒，测定它们之间的相对含量，大大提高了分辨率。

不同血清型AAV的空壳率检测
Shelley A. Nass. et al. Molecular Therapy:

Methods & Clinical Development(2018).

腺病毒的空壳率检测
Steven A. Berkowitz et al.

Analytical Biochemistry (2008).

贝克曼库尔特分析型超速离心机Optima AUC

基因组分析是制造过程中病毒载体样本的另一个重要质量属性，毛细管电泳仪亦是进行核酸分析的重要工具，SCIEX的毛细管电泳系统可进行病毒载体基因组完整性和宿主残留DNA的片段分布检测。

毛细管电泳病毒载体基因组检测结果
AAV（左），LV（右）

对于微生物、热源、不溶性微粒等工艺过程相关杂质，丹纳赫生命科学则拥有多功能酶标仪、不溶性微粒检测仪、洁净室空气颗粒计数仪等来满足日常质控检测的需要。

美谷分子仪器的SpectraMax i3x多功能酶标仪（左）
贝克曼库尔特的HIAC 9703+注射液不溶性微粒检测仪（中）

贝克曼库尔特的Metone 3400+洁净室空气颗粒计数仪（右）

面对复杂、多样、技术相对较新的病毒载体，丹纳赫生命科学凭借其先进的科技、稳定的产品和不断开发且日益成熟的应用方案，帮助用户进行创新基因治疗产品的开发。