CDE发布《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则(试行)》，一文读懂CDE推荐的分析超速离心法如何进行溶瘤病毒产品杂质检测

近期CDE发布了《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则 (试行)》，原文中对产品杂质做了阐述。在病毒生产过程中，由于病毒包装不完整或错误包装从而产生产品相关杂质，产品杂质一般包括分子变体、非完整包装病毒（如非包 膜病毒颗粒、空壳病毒颗粒等）、错误包装病毒颗粒、无活性 病毒颗粒、病毒颗粒聚集体等。原则中建议采用适宜的方法进行检测，并进行安全性评估。对产品安全性和/或有效性无影响的物质归类为工艺相关物质，需要在合适的阶段进行监测，以确保批间的一致性。此外，国际上ICH制定的《基因治 疗产品非临床生物分布考虑》指导原则，将溶瘤病毒归到基因治 疗大类，也对产品相关杂质做出了类似的规范。

对于溶瘤产品的产品相关杂质检测并非易事，主要原因在于产品相关杂质和目标产品的粒径大小、分子量、电荷等差异较小，常规手段难以达到准确检测及定量的目的。基于密度和沉降系数对颗粒进行区分是经典的分离/分析方法。CDE近日发布的《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则 (试行)》也将分析型超速离心技术列为产品相关杂质推荐方法。

溶瘤病毒指导原则通告及局部内容一览

溶瘤病毒是一类可选择性在肿瘤细胞内复制进而裂解肿瘤细胞、激活肿瘤免疫，但对正常细胞无影响的一类病毒，包括RNA和DNA病毒等，可以治 疗多种类型的肿瘤。常见的溶瘤病毒包括：腺病毒、疱疹病毒、埃可病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒及痘病毒等。

针对于溶瘤病毒产品相关产品杂质可通过分析型超速离心法（AUC）进行检测。AUC是一项曾荣获诺奖的经典技术，其发明人为瑞典著名物理化学家Svedberg。

瑞典著名物理化学家Svedberg

沉降系数是生物大分子的特征常数，分子变异体、非完整包装病毒(非包膜病毒、空壳病毒)及病毒聚体等，虽然它们粒径差异很小（聚集体除外），但沉降系数存在较大差异，故可以通过AUC技术进行检测，在体内基因治 疗领域，AUC-SV法是检测AAV产品相关杂质的“金标准”。

            分析型超速离心机 (AUC) 

硬件构成                                                                              可视化离心过程

目前上市的四款溶瘤产品，两款产品基于疱疹病毒，一款基于腺病毒，另一款基于埃可病毒。疱疹病毒呈球形，二十面体对称，双链DNA，疱疹病毒较大，直径为150-200nm，具有包膜，“naked”病毒颗粒直径100nm。AUC检测疱疹病毒的结果如下图所示：A表示的是由于DNA包装失败病毒颗粒(empty)；B表示的是含有支架蛋白核心，但不含DNA的病毒颗粒 (empty)；C为成熟病毒颗粒，包裹着DNA  (full) [1]。

疱疹病毒AUC检测结果

疱疹病毒电镜检测结果

腺病毒呈球形，二十面体对称，双链DNA，DNA在两端具有约100bp的倒置末端重复。腺病毒直径70-90nm，无包膜，沉降系数645S，AUC检测结果如下，从结果中可以得到其空壳、单体及聚集体含量的百分比[2]。

腺病毒AUC检测结果

埃可病毒(Echovirus)属于小RNA病毒科、肠道病毒属，无包膜、单链RNA(+)家族，直径24-30nm，蛋白衣壳占病毒颗粒的75%。埃可病毒成熟颗粒沉降系数143S。80S处的颗粒为Empty(含量~50%)，143S处的颗粒为成熟full病毒颗粒(~43%)，80S和143S之间的为partial，为Expanded intermediate病毒颗粒 (含量~7%)[3]。

埃可病毒AUC检测结果                                  埃可病毒电镜检测结果

对于肠道病毒属柯萨奇病毒（Coxsackievirus）[4]和脊髓灰质炎病毒[5]，二者皆为无包膜、单链RNA(+)病毒，二十面体结构，其空壳及聚集体等皆可用AUC进行检测，检测结果如下：

柯萨奇病毒AUC检测结果                    脊髓灰质炎病毒AUC检测结果

溶瘤病毒沉降系数一览

上述介绍了根据沉降系数的差异，对相关溶瘤病毒进行检测。另外，根据密度差异，对病毒产品相关杂质检测也是可行的。如下图，基于密度差异，可对腺病纯度进行分析[6]。

腺病毒AUC检测结果(基于密度差异)

对于另一些溶瘤病毒，可参考上述病毒或腺相关病毒空壳率的检测思路。溶瘤病毒作为未来最 具潜力和应用前景的肿瘤治 疗手段之一，相信在未来几年将会有更多产品进入临床并步入收获期！