技术干货 | 斑马鱼视觉神经信号研究进展及方法深度解析

斑马鱼是一种原产于南亚地区的小型热带淡水鱼，成鱼体长只有3厘米左右。斑马鱼发育速度快，受精后3天左右主要组织器官发育已经完成，5天左右开口进食，约3个月达到性成熟，寿命可达2年以上。由于斑马鱼是体外受精发育并且胚体透明，因此其组织器官的发育和变化、血流、心跳等都可以在显微镜下直接进行观察。

斑马鱼跟哺乳动物相比，具有饲养密度高（100㎡可养殖2-3万尾成年斑马鱼、养殖成本低（小鼠的1/10）、实验通量高（可在96孔板中进行高通量分析）、所需要的样品量少（100mg以内）、便于活体观察、实验周期短（大部分实验5天以内可以完成）、繁殖能力强（每队亲本一次可繁殖200枚左右胚胎）等显著优势。

由于斑马鱼和人类基因有着87%的高度同源性，作为模式生物的优势很突出，是重要的实验动物，堪称“水中小白鼠”，其实验结果大多数情况下适用于人体。

目前斑马鱼模式动物常用于以下研究领域：

1. 癌症发病机理研究和抗 癌药筛选

2. 神经系统疾病研究

3. 代谢性疾病研究

4. 药物毒性评价

5. 免疫学研究

在高级神经活动中，斑马鱼实验模型在学习与记忆中的应用比果蝇、海兔等更加广泛。斑马鱼的学习可以在很多行为中得到体现，如社会交流、觅食、航行及捕食逃避等。在斑马鱼的学习行为实验中，可以使用T迷宫，条件位置偏爱等来探讨年龄对斑马鱼学习与记忆功能的影响。

 

（斑马鱼T迷宫，条件位置偏爱箱行为实验图）

除此之外，作为一种白昼活动的鱼类，斑马鱼有明显的昼夜节律，体内的激素水平也会有一个周期性的变化。斑马鱼也会发生昼夜节律性的睡眠，对于睡眠时期的行为观察，一般常用的手段是使用具有红外线感应功能的照相机，分析其呼吸频率、心跳频率和腮动频率，再结合电生理方面的知识，从而对斑马鱼的睡眠有一个较全面的了解。

野外条件下，当斑马鱼在下雨天或是在浑浊的水中游动时，其视觉感知功能十分有限，因此除了嗅觉可能在这其中起作用外，斑马鱼具有的磁场感知功能也会发挥作用，这在斑马鱼的迁移过程中显得更加重要。

1~2 周龄的斑马鱼已具有成年动物的多种复杂行为和脑功能，但其大脑相对较小，以 1 周龄为例，约为300(背腹轴)×500(左右轴)×800(头尾轴) μm3，含有数万个神经元。在 10~20 倍物镜下，可观察其大脑全貌；通过透明的皮肤可清楚分辨单个神经元的形态，从而可以实现在全脑尺度上对神经元活动进行在体电生理或光学成像记录。

（斑马鱼钙成像模式图）

神经系统负责接受和处理各种信息，评估周围环境和自身状态，做出有利于机体生存繁衍的行为和认知决策。对神经系统的研究，目的是阐明神经元及其组成的神经环路的结构和功能是如何实现复杂的认知和行为。近年来，在斑马鱼视觉和嗅觉系统方面所取得的研究进展，为揭示感觉信息加工和处理的机制提供了新的线索。

// 视网膜功能

双极细胞(bipolar cell，BC)是视网膜神经环路中第二级神经元，其对光反应特性是视觉信息加工和处理的重要一环。通过钙成像方法，将定位到突触前的SynGCaMP2特异性地表达在双极细胞中，在活体斑马鱼上监测这些神经元轴突终末的神经活动。不论是给光反应(on response，ON)还是撤光反应(off response，OFF)、瞬时活动还是持续活动，双极细胞的轴突末都表现出类似于动作电位的“全或无”式的快速钙活动，且这种活动受到视觉输入的调节。

使用类似方法观察突触递质囊泡在细胞膜上的融合过程，通过给予不同强度的光刺激并记录相应的突触反应，约有 1/2 表现出非线性的特点: 当光刺激强度逐渐增加时，其反应经过一个极小值和一个极大值后方达到平台期。这种非线性突触具有更大的动态范围，可以更为有效地传递视觉信息。活动逐渐增强的突触与无长突细胞(amacrine cell，AC)的突起在空间位置上重叠，提示后者可能是调节的来源。光学成像记录无长突细胞对视觉刺激的反应，发现其活动逐渐降低，可能导致分布在同一亚层的双极细胞所接受的反馈性抑 制性输入下降，从而使得双极细胞的反应逐渐增强，药理实验也有同样的发现。

使用在体电生理记录方法，可以系统地分析视网膜视神经节细胞的功能发育。运用全细胞膜片钳记录方法，神经节细胞在不同发育阶段的氯离子平衡电位(ECl-)，即抑 制性突触输入的反转电位，在发育过程中逐渐向超极化方向偏移 ，从而使得抑 制性神经递质伽马氨基丁  酸 (γ- Aminobutyric acid，GABA)引起的反应由发育早期的兴奋性向发育晚期的抑 制性转变，这种转变的时间节点与神经节细胞对光反应的出现有很好的对应关系。

（微量注射/膜片钳解决方案）

// 视觉朝向选择型和方向选择型的神经环路机制

为了实现有效的信息编码，很多神经细胞会选择性地对感觉输入的某一特征(比如运动信息)作出反应，这一过程称为特征检测(feature detection)。斑马鱼的视觉中 枢即视顶盖(optic tectum)位于斑马鱼中脑背部，接受神经节细胞的轴突投射，并将信息传递至下游的多个脑区，在视觉相关行为中起关键作用。一方面，视顶盖中有为数众多的神经元其视觉反应具有方向选择性或朝向选择性; 另一方面，视顶盖空间位置和相对清晰的投射结构便于光学成像，因此，该脑区很适合研究特征检测的神经环路机制。

根据投射关系，可以推测视顶盖神经元的方向选择性和朝向选择性有2个可能的来源: 来自投射神经元神经节细胞，或来自视顶盖内部的抑 制性突触。局部抑 制性突触传递对于视顶盖神经元的方向选择性是必要的，且这些神经元所接受的抑 制性输入确实具有方向选择性。当用运动光条刺激斑马鱼时，阈下反应中的抑 制性成分较兴奋性成分具有更强的方向选择性，其方向偏好性与细胞阈上反应(即动作电位反应)的相反。此外，对于神经元偏好的方向，抑 制性突触输入的潜伏期更长; 而对于相反方向的刺激，抑 制性输入的潜伏期更短。

视顶盖神经元通过不对称方式接受邻近中间神经元的抑 制性输入，从而获得方向选择性，而发育过程中产生的特定投射关系使得顶盖神经元从前一级输入获得方向选择性; 进一步，视顶盖来源的具有方向选择性的抑 制性输入使得顶盖神经元的选择性更为显著。

// 视觉捕食行为的机制

斑马鱼视觉行为的一个主要功能是在捕食过程中识别并追踪猎物。使用不同大小的运动光点作为视觉刺激，发现 1 度视角的光点可以引起自由游动的斑马鱼汇聚双眼并朝向光点游动，类似于草履虫诱发的捕食行为。采用不同宽度的运动光条作为刺激，相对于视角 16°及以上的宽光条，窄小的刺激在该处引起的反应更强。与此不同的是，接受神经节输入的顶盖浅层区域缺乏对光条宽度的选择性，提示顶盖内的神经信息处理对于深部纤维的偏好性至关重要。顶盖表层中有一群中间神经元表现出相反的偏好性，对于16°以上的运动光条有着更强的反应，提示这群神经元的抑 制性输入可能造就了顶盖深部活动的选择性。进一步，去除或抑 制这些神经元的活动，可使顶盖深部的神经活动失去选择性，并降低了斑马鱼的捕食能力。

// 小胶质细胞对视觉功能的调节

小胶质细胞(microglia)是中 枢神经系统中重要的免疫效应细胞，激活态的小胶质细胞参与一系列免疫反应及组织修复过程。目前以斑马鱼为模式动物，发现了静息态小胶质细胞和神经元之间存在双向的功能调节。通过对小胶质细胞形态变化和神经元活动进行长时程在体记录，发现神经元活动升高后，小胶质细胞向神经元靠近并与其胞体形成紧密接触，形成接触后神经元活动降低，这两组现象之间存在相关性。人为局部增强神经元活动，发现可以吸引小胶质细胞的突起靠拢并促进紧密接触的形成，进而削弱被接触神经元的自发性电活动以及视觉反应。

>> 下篇文章将详解斑马鱼嗅觉及运动神经信号研究进展，大家敬请期待噢~

瑞沃德神经信号研究方案，涵盖神经信号调控，在体神经信号记录、离体神经信号记录等多种实验方法，从神经元单细胞、神经元群体、再到整个神经环路等不同水平，为神经科学提供系统全面的整体解决方案，助力神经环路解析及神经系统疾病机制研究的发展。

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【参考文献】

Chun-feng Shang*, Yu Mu, Jiu-lin Du*.Zebrafish Swimming into Neuroscience Research: A Visible Mind in A Transparent Brain.Scientia Sinica (2015).

Tristan Darland* and John E. Dowling. Behavioral screening for cocaine sensitivity in mutagenized zebrafish.PNAS(2001).