植物组织透明化研究进展

自17世纪中叶胡克用自制的显微镜发现了植物细胞以来，植物科学研究就一直与光学显微镜的发展密切相关。荧光标记和光学切片的发展也大大地加快了我们对组织微观形态、细胞发育、蛋白质定位和植物-微生物相互作用的研究进程，近年亚细胞级分辨率的3D成像技术也有助于研究植物的组织结构及其复杂的生理特性。然而，植物细胞本身的光学不透明特性使观察植物体及其内部组织器官受到极大限制，使成像深度被限制在了50μm左右。相比动物，植物还含有一些光敏色素和芳香族化合物，这些成分也容易被激光激发，从而在成像时产生噪音。组织透明技术结合光学成像和图像处理技术，能够将整个器官或全身快速透明并进行结构和细胞分析，为植物3D成像的发展提供了一个非常有前景的解决方案，能帮助研究人员在更接近自然的状态下观察植物的内部构造，有助于农作物品种改良、内部病虫害检测等，对推进植物学科领域的研究进展具有重要意义。（图1）

图1. 植物组织透明、三维(3D)成像和数据分析流程

时至今日，科学界已经涌现出许多先进的透明化技术，它们各具特色，适合不同领域的研究。植物体由于有细胞壁和叶绿体等特殊组分, 导致光学透明技术在植物中的应用面临很大挑战。植物组织不透明的原因主要有两点：一点是色素对光的吸收，另一点是具有大范围光折射率的细胞组分造成的光散射。为了达到生物样本光学透明的目的, 可以采用化学或物理方法去除样本中的色素和脂类物质从而减少样本对光的吸收和散射,并将样本浸入指定的匹配液中, 以获得均匀的内部折射率匹配。（图2）

图2.植物组织透明化原理

近二十年来，已有大量组织透明技术被开发应用在了植物组织成像领域。目前常用的植物组织透明方法可以分成基于有机溶剂的透明化方法和基于水性溶剂方法。

1．基于有机溶剂的光学透明技术

有机溶剂通常具有高脂溶解能力和高折射率(RI=1.5)的特点, 可使处理样品快速透明化。常见的有机溶剂透明化方法有BABB,3DISCO,uDISCO, vDISCO, PEGASOS等方法。这些方法都需要对样品先进行脱水，然后再用高折射率的试剂对样品进行折射匹配，从而实现样品的组织透明。基于有机溶剂的透明技术相对稳定, 可用于多种不同类型的组织。然而, 使用的有机溶剂大多具有毒性, 脱水过程中组织收缩严重, 以及导致荧光蛋白淬灭, 限制了有机溶剂透明方法的使用, 降低了其利用率。

Visikol for Plant Biology（锘海代理）是2013年Villani等人发明的专为植物样本设计，可替代水合氯醛，快速、易用，样本无需固定前处理，与免疫组化兼容的透明剂。他们将生姜、冬青、罗勒、牛至及拟南芥组织样本分别使用Visikol试剂（折射率为1.4450）和水合氯醛进行透明化处理及显微观察，结果表明Visikol试剂对所有被测组织样本完全可以达到与水合氯醛一样清晰度的成像效果。（图3）

图3. Visikol试剂透明化不同植物组织后显微成像结果：罗勒叶片上有气孔和头状、盾状的腺体的表皮(图1A)和叶肉细胞和叶绿体(图1B)。牛至叶脉上的表皮毛(图1C)、头状油腺细胞(图1D)和盾状油腺细胞(图1E)和叶肉细胞(图1F)。拟南芥根尖分生组织细胞(图1G)和分化木质部(图1H)

Visikol 组织透明化试剂盒

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2．水溶剂性的组织透明化方法

基于有机溶剂的透明技术无法保持荧光蛋白的的荧光以及脱水引起的组织结构的收缩，使基于有机溶剂的透明技术受到了限制。水溶剂性的组织透明化方法则具有荧光基团保护性好，生物相容性好及操作安全的优点。水溶剂性的组织透明化方法包括被动浸泡型、蛋白水化型和水凝胶包埋型三种方法。

硫二甘醇 (TDE) 是一种水溶性低黏度液体, 可以通过水溶液稀释调节折射率的范围。透明植物器官成像方法TOMEI (transparent plant organ method for imaging)就是TDE作为透明化试剂的。动物组织样品在97% TDE溶液中浸泡1–2天后体积变得非常小。而在植物组织中, 用97% TDE处理不会导致植物器官的收缩或膨胀, 植物器官可能因细胞壁的刚性而显示出对高浓度TDE的耐受性。TOMEI法主要包括固定和TDE处理2个步骤。TOMEI-I使用乙酸和乙醇（1：3，1-2h）的混合液固定样本，TOMEI-II使用4%PFA（1h）固定样本。TOMEI-II方法对样品的形态和荧光信号保存相比TOMEI-I要好。除去固定因素，高浓度的TDE（95以上）也会使内源荧光淬灭，而50–70% TDE可以很好的实现植物透明化而且对植物的样本形态和信号保存较好。但是TOMEI依然存在无法完全去除样品色素和荧光信号降低的缺点。2022年发表的iTOMEI技术可以克服TOMEI技术的缺点。iTOMEI技术使用1%PFA固定样本，使用磷酸缓冲液（PH8.0）配制20%的硫代甜菜碱去除植物色素，使用70.4%的碘海醇代替TDE用作折射率匹配试剂（图4）。

(A)

(B)

图4.不同植物组织透明化方法比较：（A）拟南芥幼苗分别用PBS, TOMEI-II, iTOMEI透明化处理；（B）对用PBS, TOMEI-II, iTOMEI透明化处理后的拟南芥叶片的H2B-GFP表达情况进行成像。

基于对蛋白质进行水化的透明化方法包括样本脱脂和蛋白水化两个步骤。为了保护样品的荧光信号，水性透明化方法使用表面活性剂进行脱脂，表面活性剂的脱脂时间比有机溶剂脱脂时间长。Warner团队使用Triton X、甘油与尿素结合使实现了玉米、苜蓿、烟草（豆属，豌豆属)和豆科植物的根瘤的组织透明化。Kurihara团队对多元醇、表面活性剂和尿素组合的化学试剂筛选后建立起木糖醇、脱氧胆酸钠和尿素相组合的具有高透明效率、多种荧光蛋白信号保护能力并适用多物种多种组织的ClearSee透明化方法。ClearSee在保持荧光蛋白活性的同时, 也降低了叶绿素自发荧光, 打破了植物组织由于叶绿素存在而造成的成像障碍。因此, 研究人员可使用ClearSee进行多色成像, 并获得植物样本中精确的三维结构和特定的基因表达模式。

但是在用ClearSee透明植物样品的时候，会出现部分样品褐化的现象，这是由于ClearSee处理会导致一些富含原花青素衍生物的组织被氧化从而使样品褐化。Daisuke团队通过在ClearSee中添加还原剂亚硫酸钠或者半胱胺盐酸盐可以有效的防止样品褐化，从而建立了ClearSeeAlpha透明化方法，鉴于半胱胺盐酸盐的价格是亚硫酸钠的100倍，故在ClearSeeAlpha中使用亚硫酸钠（图5）。Nagaki团队在ClearSee基础上建立了ePro-ClearSee透明化方法，该法在进行ClearSee透明化以前样品先进行纤维素酶对细胞壁进行酶解，然后再用异丙醇处理增加样品的通透性，从而使样品更加适合进行免疫组化反应。

图5.ClearSeeAlpha可以防止在组织透明化过程中褐色素的形成：CS: ClearSee;CS4: ClearSee+ 2-aminoethanethiol hydrochloride(半胱胺盐酸盐); CS5: ClearSee+ 2- Sodium sulfite (亚硫酸钠)

PEA-CLARITY是在CLARITY技术的基础上发展起来的一种水凝胶包埋型植物透明化方法，该方法通过使用细胞壁降解酶增加细胞壁的通透性, 以及用淀粉水解酶减少淀粉颗粒的光学干扰, 克服了植物因存在细胞壁和淀粉粒而造成的渗透和成像限制，可显著提高叶片组织的透明度。酶处理在不需要对材料进行任何切片的情况下可使抗体能够渗透到整个组织中，在保留细胞结构的同时使蛋白质在完整组织中进行3D定位。通过对荧光蛋白和抗体标记进行光学成像后, 无需对材料进行任何切片即可获取蛋白质或基因在完整组织中的三维定位。但是PEA-CLARITY透明技术也存在局限性, 如糖含量较高的组织在长时间透明过程中可能出现褐变现象, 酶处理后的组织更加脆弱, GFP等荧光蛋白的信号会减弱等。此外, 该方法处理周期较长, 通常需要4–6周才能完成样本透明。

3．其它组织透明化方法

乳酸和水合氯醛是常被用于植物透明化的两种试剂。它们能被用作植物的透明化试剂，主要是因为它们的折射率在1.43左右，折射率是和植物细胞壁的折射率比较接近的。水合氯醛被广泛的应用于植物的组织透明化，它可以对拟南芥的叶片，花朵，角果等各种组织进行透明化，而且还可以与品红，苯胺蓝，GUS等染色试剂联合使用。水合氯醛还可以与希夫试剂联合使用对细胞PI染色（mPS-PI）观察植物的细胞壁。然而水合氯醛具有麻醉性，且会淬灭植物的内源荧光，从而使该试剂在植物透明化上受到了一定的限制。

Shih等人使用不同浓度的氢氧化钠、乳酸、脂质和蛋白质水解酶、水合氯醛、甲苯及各种脂质溶剂对种子进行处理, 研发出一种改进的氢氧化钠-水合氯醛法, 可用于富含脂肪的种胚进行透明化, 该技术已经应用于枫树、油菜、西瓜及向日葵等油脂贮藏量高的种胚透明。

尽管已有多种透明方法成功应用于植物组织和器官的成像及其功能研究, 但现有透明方法应用于大体积样品的整体透明、标记与三维成像等方面仍存在巨大挑战。(1) 较为剧烈的透明化方法可去除细胞内大部分光不透明成分, 获得高度透明样本, 后期结合细胞壁特异性染料或抗体进行荧光标记或免疫标记, 可实现大体积样本内细胞形态与结构分布的荧光示踪。但剧烈的透明化处理可能造成细胞内结构和成分被严重破坏, 难以对亚细胞组分和结构进行标记和后续分析。 (2) 对于已有遗传转化体系且含有荧光标记的植物样本, 可以采用温和透明方法进行透明化处理后进行三维可视化成像, 但样本体积过大所需透明时间较长且会降低组织内部深处荧光信号的强度和对比度。(3) 对于尚未建立遗传转化体系的植物样本, 可以利用抗体免疫标记的方法进行标记与成像, 但仍需根据成像内容和目的选择合适的透明方法,防止透明化造成目标物丢失。(4) 植物的果实和种子等致密大组织材料内糖类、淀粉和脂质等含量较多, 透明方法仍需要进一步优化。总之与动物组织研究相比，植物组织透明化方法的研究仍处于早期阶段。鉴于不同植物器官的脂质、蛋白质和糖成分各不相同，所以植物组织透明化试剂还需要进行进一步系统的筛选。

透明化方法可以使组织透明，但要实现组织结构的可视化，还需要合适的成像工具。近年发展起来的光片显微镜就是适合组织透明化成像的工具。光片显微镜技术改变了传统显微镜光源照射方式，在同样信噪比的情况下光片显微镜可以将3D成像速度提高到共聚焦显微镜或双光子显微镜的数十到数百倍，而光毒性减少数十至数百倍。因此光片显微镜技术以低光毒性、高速的三维成像优势而被Nature Methods评选为2014年的年度方法学。但是传统光片显微镜存在对厘米级样本进行微米级或更高分辨率成像时成像效率不高的问题。而平铺光片技术作为一种新型的平面光片照明显微技术，通过对空间光调制器加载不同的相位图实现快速平铺短而薄的光片，从而达到扩大视场且不影响空间分辨率和光学层析能力，可以获取在视野范围内各处成像分辨率均一的高分辨率图像。锘海LS18光片显微镜采用了这种平铺光片技术，克服了传统光片显微镜中空间分辨率、光学层析能力和成像视野大小之间的矛盾，从而获得均匀高分辨率的3D荧光图像，使得3D透明化组织成像在生物医学研究中更加可靠及可行。LS18已经在脑科学、肿瘤学、药物研发、干细胞研究、组织胚胎学、组织病理诊断等各个领域得到了广泛的应用。

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参考文献：

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4. Villani TS, Koroch AR, Simon JE. An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications. Appl Plant Sci. 2013 May 7;1(5): 1300016.

5. 马灵玉,祁晓红, 胡子建, 沈微微, 王广超, 张柏林, 张曦, 林金星. 光学透明技术在植物多尺度成像中的应用[J]. 植物学报, 2022, 57(1):98-110.