您的qPCR内参选对了吗？

实时荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。由于其JZ度好、灵敏度高，在分子生物学研究和医学研究等方面得到了广泛的应用，尤其是在基因表达差异分析方面。基因表达差异分析一般是比较不同时空样本或不同处理样本（药物处理，物理处理和化学处理等）之间特定基因的表达差异。

当检测出某个基因的表达是上调或下调时，我们并不知道这种表达差异是源自于它本身表达量的变化，还是样本量大小或者操作导致的RNA的损失等其他原因导致表达量的变化。为了减少实验偏差并产生准确的表达水平，RT-qPCR往往需要考虑几个变量（如操作误差或RNA提取量、得率及变异等）进行归一化处理。目前，RT-qPCR标准化最常用的方法是使用内参基因进行均一化处理。

什么是内参基因？

理想情况下，在所有发育阶段和不同实验处理的反应中，内参基因在不同组织的所有样本中应具有相对稳定的表达水平。内参基因通常是各种管家基因，例如ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。它们的表达水平受环境因素影响较小，并且可以在生物体几乎全部组织及各个生长阶段持续表达。在不同的组织中，管家基因mRNA的含量都很丰富。

内参基因的作用

在基因表达差异分析中内参基因可以用于校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。

理想的内参基因应该满足以下条件：

1.不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的扩增；

2.高度或中度表达，排除低表达；

3.稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；

4.表达水平与细胞周期及是否活化无关；

5.其稳定的表达水平与目标基因相似；

6.不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。

内参基因的评估

然而，已有证据表明，一些用于控制实验偏差的传统内参基因仅在特定条件下是相对恒定的表达水平。很明显，内参基因是具有一定的特异性，没有通用的内参基因可用于所有实验的内控，这也表明在进行RT-qPCR实验之前，必须正确选择内参基因。那么在选择内参基因时，可以通过geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具来评估，这是保证结果可靠准确的前提。其次可对候选的内参基因进行qPCR 实验做进一步的筛选。在不同样本中均稳定表达的内参基因，即比较各样品中Cq平均值以及Cq值的标准偏差，选择SD最小的基因作为实验内参。

现在对内参基因的选择有所了解了吗？

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