光片显微镜的应用-卵巢的全组织分析

在雌性哺乳动物寿命中的任意时间，卵巢内都含有许多卵泡。但随着年龄的增长，卵泡的顺序活化ZZ使得卵巢的储备耗竭，从而导致更年期和不育。因此，卵巢内卵泡的数量和分布是卵巢健康和生育能力的可靠标志，卵泡的评分和分类已成为卵巢的生物学研究中评估生育能力的金标准。传统的卵泡计数方法依靠石蜡对卵巢包埋、切片、染色后进行人工的计数和分期，这项工作非常耗时、劳动强度大且不同研究的分类标准差异很大。尽管此前已有机器辅助的高通量卵泡分类技术，但这些研究依然是基于卵巢的组织切片。为了避免偏差并加快卵泡的评分过程，我们希望的计数方式是依赖完整的卵巢组织3D图像而不是组织切片。

近年来，透明化技术的快速发展和光片显微镜的应用，使得小鼠卵巢的三维结构得到了有效的评估，且定量研究了卵泡的直径、体积，并定位了不同卵泡处于卵巢中的位置（Yi F. Imaging the ovary. Reprod Biomed Online. 2018），文中讨论了卵巢组织的3D成像新方法。

A．使用Clarity方法处理小鼠卵巢前后的样本变化；B. Clarity处理后对样本进行2D、3D成像

最近，Biology of Reproduction发表了一篇新的有关卵巢的研究（Jennifer M. Biol Reprod. 2020），作者希望通过一种优化的透明化小鼠卵巢的方法，对成年小鼠卵巢中的卵泡储备及生长情况进行快速而准确地评估，为自动化计数模型的开发提供支持。

由于缺乏卵巢细胞特异性的荧光报告基因，以及欲使用的光片显微镜对成像液的限制性，因此作者需要一种与免疫标记和抗体渗透兼容的透明化方法。经过初步实验后作者发现：CUBIC透明化方法仅7天就可使小鼠卵巢变得透明，且MSY2抗体标记的对比实验表明：CUBIC方法与所使用的抗体兼容性良好（图1）。

图1：对小鼠卵巢应用CUBIC方法的抗体标记实验（scale bar: 300μm）

经过一系列的方法优化之后，作者对AmhCre转基因小鼠进行了3D成像，以验证CUBIC处理后的小鼠卵巢是否足够透明且均匀标记，以实现卵巢的整体成像。Tomato标记的成像结果证实了该方法对内源性信号的保护性良好，但Hoechst DNA的成像结果则表明完整卵巢尚未完全透明。此外，ENDOMUCIN对卵巢血管的标记则表明只有卵巢表面可以渗透抗体（图2）。

图2：AmhCre转基因小鼠卵巢的3D成像结果（scale bar:300μm）

从已发表的文献中，作者了解到iDISCO透明化方法可以完全透明化样本，且该方法与免疫染色兼容，但由于欲使用的光片显微镜对于成像液的限制，使得iDISCO方法与其不兼容。因此作者提出是否可以在iDISCO方法后添加CUBIC透明步骤，以在前一步的透明化结束后将样本过渡到水溶液中，但仍保留理想的iDISCO透明化结果，以实现组织的整体3D成像（图3）。

图3：iDISCO+CUBIC实验流程

作者将iDISCO+CUBIC与单独的CUBIC方法进行比较，发现荧光信号在整个组织中均可检测到（图4），证实了结合后的方法对小鼠卵巢具有更高的透明化程度与更好的抗体渗透性（图5）。

图4：两种方法的透明化前后对比（scale bar: 1mm）

图5：iDISCO+CUBIC方法的抗体渗透性验证（scale bar: 300μm）

为了快速而准确地评估小鼠卵巢中的卵泡储备，作者接下来分别免疫标记了卵泡和卵母细胞并进行了3D成像，结果发现新的卵母细胞标记物HuC/D较标准抗体标记的MVH具有更好的信噪比（图6）。

图6：不同标记物的3D图像（scale bar: 400μm）

此外，作者也表明该方法也可对卵巢内部完整的血管（图7A）和神经网络（图7B）进行成像。

图7：小鼠卵巢的血管和神经的3D图像（scale bar: 400μm）

作者认为：开发高通量的计算工具，首先需要一种快速、GX的方法对小鼠卵巢进行透明化，且需要开发其它可兼容的抗体对组织内的单个结构进行标记。作者证实了该方法可以快速、准确地评估卵泡，并利用软件进行了卵泡储备分析，此外也利用3D图像证实了卵巢成分的完整性。

锘海LS18光片显微镜

锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司自主研发的LS18平铺光片显微镜，克服了传统光片显微镜3D空间分辨率、Z轴层析能力和成像视野之间的矛盾；摒弃原有选择性平面照明显微镜中的单光片照明的方式，运用多个薄的光片分段照明，在不损失成像视野的情况下，获得更高分辨率的3D图像。LS 18光片照明显微镜适用于各种不同类型透明化方法处理的样品（水性透明化方法如Scale、SeeDB、CLARITY、CUBIC、SWITCH、SHIELD等；油性透明化方法如BABB、3DISCO、iDISCO、uDISCO、PEGASOS等），都可得到高分辨率、高信噪比的多色荧光3D图像，能够快速定位宏观样品中的目标细胞，获得高分辨率的3D细胞微结构。

锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司

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