单细胞ICP-MS联合HCS为您揭秘顺铂化疗耐药机制

　　顺铂（Cisplatin）是1978年经FDA批准用于临床ZL癌症的化疗药物。顺铂药物的ZL机制是通过结合形成Pt-DNA复合物，干扰DNA复制合成，从而杀死快速增殖的癌细胞，属于细胞周期非特异性药物。许多癌症患者Z初对基于铂类的ZL比较敏感，但一段时间后，患者通常对顺铂ZL表现出耐药性，导致了癌症复发。因此在化疗后细胞必须修复DNA 损伤，否则DNA 复制受阻会导致细胞死亡。对于顺铂的耐药机制研究，也是目前药物研究热点。目前三种主要的分子机制包括DNA 修复加速，胞浆失活加速和细胞摄取药物能力的变化。其中，细胞摄取药物能力的变化主要表现在细胞对顺铂的摄入能力降低及顺铂转运加速。

1. 单细胞水平顺铂摄入研究[1]

细胞内顺铂的摄入与肿瘤负荷相关，也就是说肿瘤对顺铂反应降低会导致细胞内顺铂的含量降低。所以，分析单个细胞水平对顺铂的摄入和分布对于评估ZL的有效性具有非常重要的意义。过多顺铂进入细胞内会增加DNA 损伤和细胞死亡的频率。了解单个细胞水平及细胞亚群对顺铂的摄入的机制将能为新疗法的开发提供科学依据，以改善肿瘤对顺铂的耐药性，降低肿瘤复发率。

单细胞电感耦合等离子体质谱 (SC-ICP-MS)是以单颗粒电感耦合等离子体质谱技术为基础，测量单个细胞（或单个纳米颗粒）在进入等离子体时产生的离散信号，对溶液中对金属元素进行评估与定量。每个细胞中的金属成分离子化，产生离子流，检测器以每秒100000 数据点的速度快速对信号采集测量，从而使得单个细胞中的金属含量能被定量到阿克（ag）/ 每细胞的水平。相比测量细胞内顺铂摄入的传统方法，SC-ICP-MS 所得结果的信息量更加全面。

通过对两株卵巢癌细胞系A2780（顺铂敏感型）和A2780/CP70（顺铂耐药型）顺铂摄入量的实时检测发现：相比A2780 敏感细胞系，顺铂摄入在耐药性的A2780/CP70 细胞系上水平降低；但顺铂摄入的细胞差异性不是由于细胞周期的不同，因为血清饥饿细胞并不改变顺铂的整体摄入。顺铂摄入的胞内差异性是由于其他尚未确定的因素造成的。

2. 单细胞水平ZX粒扩增研究（Centrosome Amplification）

“三阴性”乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancers, TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER2）均阴性的一种特殊类型乳腺癌。“三阴性”乳腺癌约占所有乳腺癌的10-20%， 但因其缺乏内分泌及抗HER2ZL的靶点，目前ZL尚以传统外科切除、化疗及放疗为主。铂类药物化疗是目前针对晚期乳腺癌ZL的标准ZL方案。[2]顺铂类药物已被报道通过解偶联DNA复制周期和ZX粒复制调控造成ZX粒扩增，从而YZ肿瘤细胞增殖。[3]

Nirmech Patel等人2018年Nature communication杂志上，结合整合基因组学、RNAi技术和功能型验证，在乳腺癌和非恶性细胞上对130多个潜在基因研究发现，有13个基因簇通过影响细胞周期检验点、DNA损伤应答和恶性细胞选择性分裂上调“三阴性”乳腺癌发病倾向。其中KIFC1驱动蛋白作为高选择性的恶性细胞靶标，通过顺铂化疗与KIFC1联合协同效果的研究结果进一部表明，KIFC1Z有潜力成为新型药物靶点。[4]

在研究顺铂化疗药物与KIFC1协同ZL实验设计中，两个关键的单细胞水平研究方法：ZX粒扩增打分和多极性有丝分裂实验，都是使用Operetta 高内涵成像系统进行共聚焦高分辨率图像采集后，再通过Hamony软件对ZX粒扩增和多极性有丝分裂进行自动数据分析及数据挖掘。

ZX粒扩增打分实验设计：

为在乳腺癌细胞模型上确认KSFC1与ZX粒扩增的相关性，11种乳腺癌相关的细胞株用于ZX粒扩增打分实验。免疫荧光方法标记ZX粒组装关键蛋白激酶Aurora A（绿色）和ZX粒标记物CP110（红色），Hoechst标记细胞核（蓝色），通过Operetta高内涵成像获取高分辨率图像，如下图b中所示，Low CA组ZX粒数量、荧光强度和面积都远低于High CA组，后续通过Hamony软件对ZX粒扩增进行分析打分，发现针对KIFC1基因的#2/#4/#5/#6四组SiRNA能有效增加KIFC1依赖的ZX粒扩增。

多极性有丝分裂实验设计：

免疫荧光标记Aurora A（绿色）和双极有丝分裂驱动蛋白Eg5（红色），Hoechst标记细胞核（蓝色），通过Operetta高内涵成像获取高分辨率图像及Hamony软件进行多极性有丝分裂分析打分，发现在3株ZX粒高扩增的细胞系和4株ZX粒低扩增细胞系中，KIFC1沉默都能显著提高单个细胞的纺锤体数量，造成有丝分裂多极性（下图a-b）。并且通过在MDA-MB-231细胞株上的实时动态检测进一步验证了KIFC1沉默对有丝分裂多极性的影响（下图c）。

后续通过进一步实验研究验证，顺铂药物能提高ZX粒扩增，且能在KIFC1沉默的情况下，提高顺铂药物对ZX粒扩增的敏感性。这就意味着KIFC1蛋白可以作为顺铂化疗药物联合ZL的潜在药物靶点，用于针对三阴性乳腺癌患者的jing准ZL方案。

References:

1. Z新研究进展——利用单细胞电感耦合等离子体质谱评估卵巢癌细胞对顺铂的摄入

2. Untch, M. et al. ABC3 consensus commented from the perspective of the German guidelines: Third International Consensus Conference for Advanced Breast Cancer (ABC3), Lisbon, 07. 11. 2015. Geburtshilfe Frauenheilkd. (2016) 76,156–163.

3. Zou, J. et al. FancJ regulates interstrand crosslinker induced centrosome amplification through the activation of polo-like kinase 1. Biol. Open  (2013) 2,1022–1031.

4. Nirmesh Patel et al. Integrated genomics and functional validation identifies malignant cell specific dependencies in triple negative breast cancer. Nature Communication (2018) 9:1044.