如何选择符合您需求的HPLC或UHPLC色谱柱

1.利用ACE键合相的固定相选择

分离度方程式可以确定影响分离度的参数：柱效（N）、容量因子（k）和选择性（α）。

在过去几年里，柱效和使用超GX色谱柱（被称为“UHPLC”色谱柱）作为实现分离目标的手段已得到了极大的重视。

UHPLC已通过更快速的分离和更快速的方法开发提高实验室生产力来证明了其价值。

然而，选择性往往被忽视，且其重要性也被强调柱效所掩盖。这是令人遗憾的。

在影响分离度的三个参数中，选择性是Z为重要的。

（参见图1）通过利用柱效和选择性，通常可以实现更好和更快的分离。

图 1：N、α和k对分离度（Rs）的影响

提高N，α或k可以提高分离度（Rs）。

然而，从这些图中可以看出，随着N或k值的提高，对分离度的改善效果也逐渐降低。

另一方面，提高选择性（α）则没有这个问题，因此其成为开发分离方法时的Z佳优化变量。

在反相色谱中，固定相与分析物之间存在多种相互作用的机制，这可以用来实现分离。

这些相互作用机制包括：疏水性结合、π-π、氢键、偶极-偶极和形状选择性。

不同类型的键合相将提供其中一种或多种相互作用机制。表1列出了ACE键合相和每种可能的主要相互作用机制，这取决于分析物和流动相条件。

表1: 比较不同键合相的分离机制/相互作用                                                                                  

利用键合相的选择性实现更好的分离。
图2表明了两种ACE键合相即C18-AR与苯基之间的选择性差异。
尽管两种键合相提供了强π-π和偶极-偶极相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用机制（特别是疏水性结合）的强度方面，它们存在显著差异。

C18-AR可能具有其它不同的分离机制，可以为复杂的混合物带来更好的分离效果。对于其他混合物，可能不是这种情况，这是ACE键合相的优势。

当开发分离方法时，ACE键合相可以提供各种可供选择的重要保留机制。

非常强大且独特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色谱柱中可以获得。
通过利用柱效和选择性，可以实现更好的分离。

图 2：C18-AR与苯基相之间选择性差异的比较

色谱柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流动相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
温度： 60 ℃
检测： UV 214 nm
梯度： 5分钟内从3至B，并持续1分钟。

样品：
1. 甲硝唑
2. 3-羟基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水杨酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎宁
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡罗昔康
16. 卡维地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，这可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的选择性。还要注意C18-AR与苯基相的洗脱顺序有很多变化。

图3给出了键合相选择能力的另一实例。

一个分离是用C18键合相的UHPLC色谱柱完成，另一个分离是用C18-PFP键合相的UHPLC色谱柱完成。

C18-PFP键合相提供的额外分离机制，使得总体分离效果更佳出色。

图 3：ACE Excel可以获得zhuo越的分离度和峰形：药物及其相关物质的UHPLC结果

条件
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm
流动相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分钟内从3至B
流速：0.6 mL/min
温度：40 ℃
检测：UV 254 nm

样品
1. 对乙酰氨基酚
2. 氢氯噻嗪
3. 甲基苯基亚砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色谱柱和C18-PFP色谱柱上同样快速地产生色谱图。

然而，C18-PFP色谱柱可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更佳的选择性，因此能够提供优越的总体分离性能。

2.ACE和ACE Excel硅胶基质固定相几乎消除了硅醇基对色谱分离的不利影响，并且在为碱性化合物提供zhuo越峰形方面赢得了口碑。  

峰拖尾可以降低分离度，降低灵敏度，甚至干扰准确度和精密度（图4）。  

峰拖尾有许多潜在的原因，但分离碱性物质时的主要原因是硅胶固定相载体颗粒表面上的酸性硅醇基与分析物上的氨基之间的相互作用（图5）。  

图 4：峰拖尾对分离度和灵敏度的影响  

随着峰拖尾（Tf，拖尾因子）从1.0增加到2.0，分离度（Rs）从1.5下降到0.87。  

由于峰宽增加以及峰面积保持不变，灵敏度（峰高）也随着峰拖尾的增加而下降。  

ACE色谱柱采用具有极低硅醇活性的超惰性硅胶制成。  

这种超纯硅胶采用ZL技术进行有效键合和彻底封尾。  

导致这种硅胶基质的固定相几乎消除了硅醇基对色谱分离的不利影响。  

ACE色谱柱的超惰性特性使其成为分离极性碱性化合物的理想选择。  

当分离复杂碱性化合物时,与其他现代碱性去活色谱柱相比，ACE色谱柱总是能给出明显更好的峰形和柱效（图6）。  

图 5：峰拖尾相互作用  

硅胶固定相载体表面上的酸性硅醇基可形成与碱性化合物相互作用的离子交换位点。  

这种离子交换的相互作用通常可以导致峰保留（二次保留），并当采用反相HPLC分离胺类化合物时引起峰拖尾。  

一种几乎消除了硅醇基对色谱分离不利影响的硅胶基质固定相  

图 6：峰拖尾比较  

条件
色谱柱尺寸：50 x 2.1 mm
流动相：40％甲醇，60％水
流速：0.2 mL/min
温度：22ºC
样品：吡啶  

报告了碱性化合物（吡啶）在各种常见C18色谱柱上的塔板数。  

在10％峰高下测量塔板数，以使峰拖尾纳入在测量中。  

ACE C18-PFP由于其超惰性性质而达到了Z高塔板数。  

3.ACE Excel为UHPLC带来了享有盛誉的ACE HPLC性能  

重要的是要认识到色谱柱的选择性和柱效是独立的变量，在开发分离方法时您不必选择使用一种而不使用另一种。事实上，为了实现Z佳的总体分离效果，您应当对上述两个变量以及保留值进
行优化。当需要实现高速分离时尤其如此。（参见图7）  

图 7：利用柱效和键合相选择性来开发更快的分离方法  

条件：
流动相：  

A = 5mM甲酸（0.189）ml / L;
A = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
柱温：40℃
检测：PDA, 254nm  

样品：
1. 阿司匹林
2. 非那西丁
3. 1,3-二硝基苯
4. 苯甲酸乙酯  

5. 尼美舒利
6. 布洛芬
7. 吲哚美辛

利用UHPLC色谱柱更高的柱效，可在更高的流动相流速下使用更短的色谱柱，以使这种混合物的分离时间缩短80%（相比HPLC色谱柱）。
然而，也可以通过优化键合相的选择性来进一步缩短分离时间，在这个案例中，就是利用了C18-PFP键合相所具有的增强的选择性。

与C18UHPLC色谱柱、C18 HPLC色谱柱相比，ACE Excel C18-PFP UHPLC色谱柱分别将混合物的分离时间缩短了80％以上以及96％，同时保持了所有峰的分离度。

ACE Excel UHPLC色谱柱的设计旨在充分利用低扩散、超高压UPLC®和UHPLC仪器（高达1000 bar），并可与所有市售UPLC和UHPLC系统相兼容。
ACE Excel UHPLC色谱柱可以为碱性化合物提供更佳的峰形，改善柱子与柱子之间的重现性，提供额外的利用多种分离机制的固定相，以及改善色谱柱的耐用性。

ACE Excel UHPLC色谱柱的可用性意味着色谱分析师在使用UPLC和UHPLC仪器时有更多的选择来获得更好的结果。

图 8：ACE Excel色谱柱提供快速、高分辨率的分离

条件
色谱柱：ACE Excel C18, 2 μm, 3.0 x 50 mm
流动相：60秒内从30%B至B
A =水+ 0.1％TFA B =乙腈
流速：2.5 mL/min
柱温：40ºC
压力：703 bar (10,335 psi)
检测：PDA, 254 nm
仪器：安捷伦1290 UHPLC
化合物
1. 乙酰苯胺
2. 苯乙酮
3. 苯丙酮
4. 苯丁酮
5. 二苯甲酮
6. 苯戊酮
7. 苯己酮
8. 苯庚酮
9. 苯辛酮

ACE Excel C18色谱柱可在不到60秒内提供这9种分析物的基线分离。

4.已经证实ACE HPLC色谱柱和ACE Excel UHPLC色谱柱具有持久耐用的、可靠的日常性能和zhuo越的色谱柱寿命。  

通过键合在硅胶固定相载体上的硅氧烷的酸化水解可以失去键合相，从而降低色谱柱的寿命。该酸水解随着流动相pH的降低和柱温的升高而增加。  

与C18相相比，较短的烷基相如C4和C3以及苯基相通常更容易失去键合相。此外，低纯度的硅胶固定相载体和低表面覆盖的固定相载体使得一些键合相更易于酸解。
由于使用超高纯度的硅胶固定载体粒子以及键合相的极高表面覆盖，ACE键合相表现出极高的稳定性。（参见图9）
尽管所有ACE键合相的稳定性都很优异，但是一些键合相并不像其它键合相那样稳定。例如，通常认为C18键合比柱长较短的烷基相、PFP相和苯基键合相更稳定。  

实际上，典型的苯基固定相稳定性不佳是该相在方法开发中不常被选择的主要原因之一。
为了解决这个问题而开发了ACE C18-AR，其允许色谱分析利用强大的π-π和偶极-偶极分离机制，并仍然享有C18相的坚固性及耐用性。  

如图10所示，ACE C18-AR不仅对典型的苯基键合相具有非常优异的稳定性，它甚至还比许多其他C18键合相表现出更佳的稳定性。  

类似地，ACE C18-PFP提供了多种分离机制，可以利用它们实现更佳的总体分离效果，同时从C18相的稳定性中受益。  

图 9：酸稳定性，pH 1.8  

条件
色谱柱：ACE 4.6 x 150 mm
流动相：50% CH3CN, 50%水
流速：1.0 mL/min
温度：22 °C
分析物：菲  

酸性暴露条件：
流动相：50% CH3CN 50% 0.1%TFA（溶于水中）（pH 1.8）
流速：1.0 mL/min
温度：22 ℃  

图10：加速柱稳定性研究：pH 1.9时80℃  

酸性暴露条件：
流动相：5:95 MeOH/0.1% TFA（溶于水中）（pH 1.9）
流速：0.20 mL/min
温度：80 ℃
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm
分析物：菲  

使用设计用于加速柱降解下的条件，ACE C18-AR相显示保留损失极少，其寿命相当于高度稳定的ACE C18相。两种固定相均由相同的超纯硅胶而制成，而且比Zorbax SB-C18的耐久性更好(Zorbax SB-C18曾视作在高温和低pH条件下具有极好稳定性的固定相）。
正如预期的那样，基于低纯度硅胶（Waters Spherisorb ODS2）的C18键合柱在这些加速条件下寿命大大降低。
特别值得注意的是常规苯基色谱柱与ACE C18-AR的寿命比较结果。与ACE C18-AR相比，尽管使用高纯度二氧化硅，苯基色谱柱的寿命仍降低，这表明ACE C18-AR可能适用于那些使用苯丙基色谱柱寿命短的应用。  

将HPLC和UHPLC连接到通常被称为LC-MS的质谱仪上已经相当普遍。  

然而，质谱对可能从HPLC/UHPLC色谱柱上洗脱下来的微量的键合相（称为柱“流失”）非常敏感。柱  

流失可能会干扰分析结果，并且重要的是，LC-MS应用中所选择的色谱柱具有足够稳定的键合相以避免过量的柱流失。  

图11表明ACE C18-PFP色谱柱几乎没有“流失”干扰LC-MS分析。  

C18-PFP（以及ACE C18和ACEC18-AR）的稳定性使得这些色谱柱更适合LC-MS应用。  

图 11：ACE C18-PFP色谱柱的低柱流失使其成为LC/MS应用中的理想选择  

条件
色谱柱尺寸：50 x 3.0 mm
流动相：梯度：在5分钟内从5至95% B，95% B时持续5分钟
A: 0.1％甲酸(溶于水中)
B: 0.1％甲酸(溶于乙腈中)
流速：0.43 mL/min
温度：60ºC
检测：安捷伦1100 MSD ESI正离子快速扫描模式,快速扫描全50 – 1000 m/z
样品：空白运行  

柱流失可能会干扰LC-MS应用中目标分析物的检测和测量。  

ACE C18-PFP色谱柱未显示柱流失。  

所有ACE色谱柱的低流失特性使其非常适合LC-MS应用。  

UHPLC色谱柱可能缺乏耐用性。加上入口筛板堵塞的可能性，您可能面临色谱柱的耐用性不如HPLC色谱柱的问题。  

ACE Excel色谱柱非常宽容，并提供您期望从HPLC色谱柱中获得的相同耐用性和使用寿命。  

ACE Excel将改变您对UHPLC色谱柱耐用性的看法。  

ACE Excel色谱柱不仅填装的更好，还采用了ZL的入口筛板设计，使其比其它UHPLC色谱柱更不容易被堵塞。  

仍建议您像使用任何UHPLC色谱柱一样过滤样品和流动相，但ACE Excel色谱柱比其他UHPLC色谱柱更为宽容，并提供与HPLC色谱柱相同的耐用性和使用寿命。  

图 12：ACE Excel色谱柱在耐用性方面有良好的口碑  

将2.1×100mm ACE Excel C18 UHPLC色谱柱在平均1,000 bar（14,500 psi）压力下进行2000多个梯度的运行。  

在该稳定性研究结束时，柱效（塔板数）和保留时间基本保持不变。  

5.ACE Excel色谱柱具有口碑zhuo越的可重现性。  

柱子与柱子之间的可重现性受硅胶固定相载体的生成、固定相与固定相载体的键合以及色谱柱中固定相的填充的影响。  

在色谱柱的制备过程中，每个阶段被控制得越好，色谱柱的可重现性和质量则越好。
ACE色谱柱在色谱柱制备过程中的每个阶段均得到了全面控制。  

这些控制措施确保ACE色谱柱在柱间以及批次之间产生可靠且可预测的性能。  

图13提供了典型批次验证测试的实例。  

硅醇活性的细微变化是柱子与柱子之间选择性变化的主要原因之一。  

ACE和ACE Excel色谱柱由于使用超纯试剂和严格的制造工艺控制（可以获得具有均一表面特性的高纯度硅胶固定相载体）而具有出色的可重现性。  

将这种高纯度硅胶与先进的键合技术相结合，可以产生一系列高惰性的固定相，这些固定相几乎消除了色谱中的硅醇干扰，从而提供zhuo越的柱子与柱子之间的可重现性。  

6.ACE色谱柱可以提供从UHPLC到HPLC再到制备型HPLC的易扩展性。  

相同的质量控制，可以确保不同批次色谱柱的高重现性，也可以保证您更容易地在UHPLC和HPLC方法之间进行转换，或需要分离和纯化目标化合物时放大到制备应用上。  

柱效当然会改变，但可以预料的是，谱带间距（选择性）将相同。  

图14阐明了当使用相同的ACE键合相但不同粒径填充的色谱柱进行操作时，可以预见到分析物一致的谱带间距类型（选择性）。  

图 14：将ACE固定相从UHPLC（2μm）扩展到HPLC（3μm和5μm）再至制备型HPLC（10μm）时，选择性得到了保留与保证。

条件
流动相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
温度：22 ℃
波长：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羟基苯甲酸
3. 乙酰水杨酸
4. 苯甲酸
5. 2-羟基苯甲酸
6. 对羟基苯甲酸乙酯

试验样品的这些色谱图在填充有相同的键合相但不同粒径的色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明分离从UHPLC扩展到HPLC再到制备型HPLC的容易程度。

当使用ACE Excel UHPLC色谱柱进行快速方法开发，且该方法必须可转移到HPLC时，易扩展性则显得特别有价值。

图 15：ACE固定相可以提供相同的选择性，无论它们是UHPLC、HPLC还是制备型HPLC色谱柱

条件
色谱柱：2.1 x 50 mm
流动相：1.4分钟内从30% B至90% B
A = 20mM甲酸铵+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B时持续0.30分钟，在1.10分钟内从30至90％B，在90％B时持续0.40分钟
流速：0.5 mL/min
柱温：30ºC
检测：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式运行
仪器：岛津Prominence UFLC系统

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普罗替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

试验样品的这些色谱图在ACE Excel C18 2μmUHPLC色谱柱、ACE C18 3μmHPLC色谱柱和ACE C185μm色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明ACE固定相的选择性一致，无论填充粒径如何。

这使得从UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法转移更加容易。同时也使得从分析型应用扩展到制备型应用更加容易。