如何设计引物，扩增目的基因的ORF

如何设计引物，扩增目的基因的ORF
无论您是先提RNA再做反转录，还是直接从DNA中获得基因，考虑到模板的复杂性，都应当使用巢式PCR.建议您先从目的基因的上下游设计一段引物，即外引物，再根据目的基因上下游设计一段内引物.
外引物不在目的基因上，可以在目的基因上下游100bp以内，这就可以利用引物设计软件找出Z的引物，提高了diyi次PCR的成功率.将diyi次PCR产物做模板，进行第二次PCR，这样如果P出了大小正确的条带，就可以肯定是你的目的条带.因为两次特异性扩增再加上大小正确，这样的总特异性是极高的.
另外，由于在第二次PCR过程中，模板是diyi次PCR产物，成分单一，就是内引物再糟糕，也没有问题，这就规避了你提到的“那如果在CDS区两端设计不出引物怎么办?”这个问题.