仪器社区

超声波破碎后的细胞沉淀是怎么进行电泳的

zhaohu6300 2016-03-05
评论
全部评论
默念最初
对细胞破碎后获得的生物大分子的电泳方法大都采用凝胶电泳。如果要分析核酸等大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳;如果是分析蛋白质,则通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行。
以DNA凝胶电泳为例,电泳的操作步骤如下:

1、安装电泳槽
将有机玻璃的电泳凝胶床洗净,晾干,用胶带将两端的开口封好,放在水平的工作台上,插上样品梳。
2、琼脂糖凝胶的制备
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中,(按0.3-1.5%的琼脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝胶,20-100kb的DNA用0.5%的凝胶,200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶)置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。
3、灌胶
将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
4、待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。
5、加样
将DNA样品(DNA样品是细胞破碎之后用离心管离心沉淀获得的)与加样缓冲液按4:1混匀后,用微量移液器将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μl,记录样品的点样次序和加样量。
6、电泳
安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至3-5V/cm,电泳1-3hr,当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时,停止电泳。
7、染色和观察
取出凝胶,放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min,即可在254nm的紫外灯下观察,有橙红色荧光条带的位置,即为DNA条带,或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂,操作时要小心,必须戴手套。

扩展知识:

在外加直流电源的作用下,胶体微粒在分散介质里向阴极或阳极作定向移动,这种现象叫做电泳。利用电泳现象使物质分离,这种技术也叫做电泳。
凝胶电泳通常用于分析用途,但也可以作为制备技术,在采用某些方法(如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹)检测之前部分提纯分子。
琼脂糖 ( Agarose ) 是一种线性多糖聚合物 , 系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的 电泳介 质 , 其密 度是由 琼脂 糖的浓 度决 定的。经过化学修饰的低熔点 (LMP) 的琼脂糖 , 在结构上比较脆弱 , 因此在较低的温度下便会熔化 , 可用于DNA片段的制备电泳。
聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式 : 一是用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶。在未变凝胶中分离 DNA的缺点是DNA的迁移 率受碱 基组成和序列的影响。由于无法得知未知DNA的迁移是否反常 , 故不能用未变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳确定双链DNA的大小。二是用于分离及纯化单链DNA片 段的变性聚丙烯 酰胺凝 胶。这类聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对YZ剂 ( 尿素或甲酰胺 ) 的存在下聚合而成 , 变性DNA的移动速度同其碱基组成及序列几乎完全无关 , 故可用于分离及纯化单链DNA片段和DNA测序等。
14 0 2016-03-06 0条评论 回复
您可能感兴趣的社区主题
加载中...
发布 评论