细胞凝聚反应 实验结果

凝集反应（agglutination）
一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。

直接凝集反应 颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。玻片法是一种定性试验方法。可用已知抗体来检测未知抗原。若鉴定新分离的菌种时，可取已知抗体滴加在玻片上，将待检菌液一滴与其混匀。数分种后，如出现肉眼可见的凝集现象，为阳性反应。该法简便快速，除鉴定菌种外，尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。试管法是一种定量试验的经典方法。可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。操作时，将待检血清用生理盐水连续成倍稀释，然后加入等量抗原，Z高稀释度仍有凝集现象者，为血清的效价，也称滴度，以表示血清中抗体的相对含量。诊断伤寒、副伤寒病的肥达氏反应（Widaltest）、布氏病的瑞特氏反应（Wright test）均属定量凝集反应。

间按凝集反应 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（O型）和动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接凝集反应高得多。

当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透人的溶质分 子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞 内溶质浓度增加时，导致水的摄人。红细胞膨胀 到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细 胞发生溶血.由于溶质透人速度不同，溶血时间 也不同.

洋葱鳞叶外表皮可观察初生纹孔场 撕取长5mm、宽3 mm的洋葱鳞叶外表皮，制片，光学显微镜下观察，可以看到洋葱细胞的壁厚度是不均匀的，有的地方较厚，有的地方较薄，这较薄的区域即初生纹孔场.

1 引言

细胞骨架是真核生物细胞中的重要结构，起细胞支架的作用，并参与胞内物质运输、细胞运动、分泌吸收、细胞通讯、有丝分裂等。由于与细胞各项功能的密切关系，细胞骨架的研究已成为当今细胞生物学中较具吸引力的领域之一。对细胞骨架的研究须先对其进行观察。本实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料对细胞骨架进行观察研究，基本原理是细胞内脂质和大部分蛋白质可与去垢剂Triton-100形成去垢剂-蛋白/脂质复合物，从而溶于水中被提取，而结合成纤维状的细胞骨架蛋白则保持其在生活细胞中存在的状态。之后用考马斯亮蓝对蛋白质染色，使骨架系统在光学显微镜下可见，从而对其进行观察研究。

2 材料与方法

2.1 材料

新鲜洋葱鳞茎，撕取内表皮，切成约0.5cm×0.5cm大小。

2.2 器材

光学显微镜、精确天平、0.02ml移液枪、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子。

2.3 试剂：

M-缓冲液：50mmol/L咪唑、50mmol/LKCl、0.5mmol/LMgCl2、0.1mmol/LEDTA、1mmol/LEGTA[乙二醇双（α-氨基乙基）醚四乙酸]、1mmol/L巯基乙醇。
6mmol/LPH6.8磷酸缓冲液：0.2149g Na2HPO4·12H2O、0.0816g KH2PO4 加入100ml 蒸馏水。
1％TritonX-100：0.5ml 100％TritonX-100加入A液49.5ml。
0.2％考马斯亮蓝R250：0.2g考马斯亮蓝R250粉加入甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。
3％戊二醛：6ml 25％戊二醛加入B液44ml。
2.4 方法

将材料置于装有PH6.8磷酸缓冲液的烧杯中，使其下沉。吸去磷酸缓冲液，用1％TritonX-100处理30分钟。吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次10分钟。0.2％考马斯亮蓝R250染色30分钟。用蒸馏水洗1-2次，展平置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。选取骨架形态清晰、典型的细胞或细胞群，在适当放大倍数下摄像。

3 结果与分析

3.1 细胞骨架观察结果

光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见（如图1），细胞壁及其分界明显。10×10倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀，细胞核区域的纤维相对密集，蓝色浓重，甚至分辨不出网络结构，另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布；相邻细胞的密集程度基本一致，但有少数细胞有较大不同。10×40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成，纤维间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架较稀疏，但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓，与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。

3.2 细胞骨架的分布

制片可观察到较清晰的骨架结构，但是不同切片的细胞骨架在密集度、分布上有差异，可能是处于不同生理状态或处理时间不同所致。对于同一切片，边缘部分的细胞骨架较稀疏，说明Triton-100对细胞骨架蛋白有破坏作用，也反映了细胞骨架蛋白间的结合是可逆的。

3.3 核骨架

多数切片上的细胞可见蓝色较浓重的核区（图1a），但在用Triton处理较久的切片上没有核区轮廓，表明核骨架在形态分布上与细胞质骨架并无明显（至少在光镜下）差异，但由于胞核有核纤层支撑的核膜，较难被去垢剂破坏，使去垢剂难以进入核中起作用，故需处理较长时间才能得到与胞质同样的效果。

图1洋葱鳞茎内表皮细胞骨架显微镜照片

a：10×10倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（箭头示细胞核区域重染色区）

b：10×40倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（上方箭头示膜骨架，下方箭头示胞间连丝处骨架纤维）

c：10×100倍光镜下病变细胞骨架与正常细胞的对比（注意两箭头处染色对比）

3.4 膜骨架

对于去垢剂的提取作用，细胞质膜首当其冲，膜脂，膜蛋白必然很快溶解，但在显微镜下可见到紧贴细胞壁的包绕细胞质的一层结构（图1b），表明细胞除胞壁维持形态外，还有膜骨架（或膜内侧细胞骨架）起作用。而且膜骨架并非孤立起作用，可观察到它与胞质内部骨架系统通过与壁垂直的纤维相连。

3.5 胞间连丝

植物相邻细胞通过胞间连丝相通，交换物质。切片上可见细胞相邻胞壁有纤维穿过（图1b），由此也验证了胞间连丝并非单纯的细胞壁上的穿孔，而是有细胞骨架参与构成的[1]。另外，切片边缘的细胞蓝色网络较稀释的现象可由胞间连丝解释：由于洋葱内表皮细胞单层排列，与鳞茎内部的茎肉细胞联系较少，少或没有胞间连丝；去垢剂要直接通过胞壁毕竟较难，但可以很快通过胞间连丝进入细胞，故边缘的细胞其胞间连丝直接暴露于外部溶液中，去垢剂进入起作用并流向内侧细胞，造成较快和较强的反应。

3.6 病变细胞的骨架

细胞骨架对细胞的生存有重要作用，故细胞骨架可在一定程度上反映细胞的生理状态。制片中可见个别细胞纤维网络与附近细胞相比非常稀疏（图1c），由于细胞骨架必须形成一定密度的网络系统才能维持细胞的正常功能，可推测这些细胞发生病变或已经死亡。这些细胞有一个特征，即胞质边缘的蓝色较浓重，但不呈纤维状，可以猜测由于病变，骨架纤维断裂，断裂片段转移到其他细胞进行再利用。

4 小结

细胞骨架在细胞中呈由蛋白纤丝交织成的立体网状结构，并且处于动态变化中。细胞骨架在胞质、细胞核、质膜、胞壁中都有分布，参与细胞形态维持、物质运输、信号转导等作用。处于不同生理状态的细胞其细胞骨架有变化，可根据细胞骨架推测细胞所处生理阶段。

该实验设计简明、结果易得，但是对于细胞骨架的研究有许多不足：只能大概提供细胞骨架形态分布的情况，不同种类细胞、同种类细胞在不同生理状态下、细胞不同部位的形态分布则没有涉及；笼统地把不溶于去垢剂的物质作为细胞骨架，并且没有区分细胞骨架的不同成分；处理中将细胞破坏，观察的是死细胞的细胞骨架，且可能已受到去垢剂的影响；不能观察细胞骨架的重要特点——动态不稳定；不能观察细胞骨架与细胞器的相互关系。综上，该实验只是对细胞骨架

的Z初步研究，但也是Z基本的研究。对细胞骨架的深入研究要利用细胞培养，电子显微镜和荧光显微镜等技术

细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。

不知道你做的哪种细胞的凝集反应实验，也不知道你需要什么样的实验结果。我们做的是红细胞的，结果是确定在什么浓度下细胞发生凝集.当时用的是十二孔的模版，我记得一般是在第六或七孔开始产生凝聚现象。不过我忘了浓度是多少了，如果你有数据应该可以算出来的。

红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透人的溶质分 子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞 内溶质浓度增加时，导致水的摄人。红细胞膨胀到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细胞发生溶血.由于溶质透人速度不同，溶血时间也不同.

洋葱鳞叶外表皮可观察初生纹孔场 撕取长5mm、宽3 mm的洋葱鳞叶外表皮，制片，光学显微镜下观察，可以看到洋葱细胞的壁厚度是不均匀的，有的地方较厚，有的地方较薄，这较薄的区域即初生纹孔场.

至于细胞骨架，给你个网址吧
http://www.bbioo.com/bio101/2006/7684.htm

红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透人的溶质分 子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞 内溶质浓度增加时，导致水的摄人。红细胞膨胀 到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细 胞发生溶血.由于溶质透人速度不同，溶血时间 也不同.