不可培养微生物的研究方法和研究意义

稀释培养法和高通量培养法 d.pp3D 9/
在地球环境中，海洋环境中迄今可培养微生物的比例Z低，仅为0.001% ～ 0.1%，这是由于海洋环境中主要是寡营养微生物，它们在人工培养时往往受到少数优势生长的微生物的竞争作用而不能生长。为了克服该缺陷，1993 年Button从概率论的角度提出一个崭新的方法，即稀释培养法（Dilution culture）。该方法认为，当把海水中微生物群体稀释至痕量时，在海水中主要存在的寡营养微生物可以不受少数几种优势微生物的竞争作用的干扰，因而主体寡营养微生物被培养的可能性会大大提高。随后，Schut等的实际操作验证了该理论的正确性。 ';/84j-3F
2002 年Connon在稀释培养法的基础上提出高通量培养法（High-throughput culturing，HTC）。将样品稀释至痕量后，采用小体积48 孔细胞培养板分离培养微生物。该方法不仅有效提高微生物的可培养性，还可在短期内监测大量的培养物，大大提高工作效率。Cho等利用该方法从太平洋近海和远洋海水中也分离出多种新菌。Rappé 和Connon结合荧光原位杂交技术（FISH），对高通量培养法进行了改进，根据从培养板各孔中针对性地检测SAR11 进化分支的海洋细菌的存在，在较短时间内对目标微生物进行了大量的培养。但是，稀释培养法和高通量培养法成功的原因恰恰又是制约其进一步发展的障碍。在样品稀释、微生物间的不利作用被削弱的同时，有利作用也被削弱。例如，当微生物被极度稀释、初始接种量很小时，一些微生物分泌的代谢产物也被稀释，其他关联微生物细胞由于缺乏这些必须的代谢产物，生长就会受到YZ；另外，缺少种间的共生关系和群体效应，很多微生物仍然不可培养。 O3!d(dY=_
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3.2 扩散盒培养法 GOW"o"S
Kaeberlein〔2〕等在分离培养潮间带底泥中的微生物时使用一种新颖的自制培养仪器，为其起名为扩散盒（Diffusiongrowth chamber）。扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的0.1μm 滤膜组成，滤膜只能允许培养环境中的化学物质通过而不能让细胞通过。将底泥样品置于扩散盒内的半固体培养基中，扩散盒置于鱼缸底部的天然海洋底泥上，往鱼缸内加入天然海水并保证扩散盒内存有一定空气供微生物生长。培养时，使天然海水循环流动，并不断注入新鲜的海水。培养1 周后培养基上产生大量的微型菌落，数目高达接种微生物的40%。这种培养方法能较大程度地模拟微生物所处的自然环境，由于化学物质可以自由穿过薄膜，可保证微生物群落间作用的存在，提高微生物可培养性。扩散盒法的主要不足是操作比较繁琐。 b%nkIPA
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3.3 细胞包囊法 hNO )~rt
Zengler 等将海水和土壤样品中的微生物先进行类似稀释培养法的稀释过程，然后乳化，部分微生物形成了仅含单个细胞的胶状微滴。然后将胶状微滴装入层析柱内，使培养液连续通过层析柱进行流态培养。层析柱进口端用0.1μm 滤膜封住，防止细菌的进入而污染层析柱；出口端用8μm 滤膜封住，允许培养产生的细胞随培养液流出。该方法的特点是让微生物在开放式培养液中生长，使培养环境接近于微生物的自然生长环境，能够很好地提高微生物可培养性，但成本较高，不利于普及使用。 & zgPN8u
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3.4 序列引导分离技术 _:5=| 2-E
序列引导分离技术（Sequence-guiding isolation）是根据微生物基因组中特定基因的特异性序列，设计引物或杂交探针，以培养物中目标序列存在和变化情况为标准，来指导对微生物Z优培养条件的选择，培养出新的微生物。Stevenson在细菌培养过程中采用了多种培养条件的组合，导致培养方案繁多复杂。为了减少分离细菌的工作量、节省时间，用PCR 作为监测手段来确定目标细菌是否得到培养。当细菌在固体培养基上长出菌落后，用缓冲液冲洗培养基表面，提取冲洗液中细菌的DNA，根据目标细菌的16S rDNA扩增情况判断目标细菌的存在与否。继续用PCR方法监测目标细菌直至分离得到纯菌株。Béjà 等通过对尚未培养的海洋变形细菌的BAC 基因文库进行研究，发现该类菌具有编码视紫红质的基因片段。视紫红质是光营养过程中不可或缺的化学物质。据此设想增加光照可提高该菌的可培养性，而进一步的实验结果验证了该假设的正确性。此外，Breznak指出，分子原位杂交技术可以对推断目标微生物的代谢方式和营养需求提供帮助，极大地节省工作时间，操作也很简便，仅需要一种特异性的探针，显示了在微生物培养时引入分子生物学技术作为引导的优势和力量。

现在流行的宏基因组学中一部分就是搞这个不可培养的微生物的。