技术干货 | 神经环路研究中在体钙信号的检测方法

       对清醒自由活动动物神经系统的研究，是当代神经科学研究中一个至关重要的问题。通过检测神经元活动相关的钙信号，我们能够更好地理解复杂的神经回路。

       近年来，包括双光子显微镜，微型显微镜和光纤记录法在内的技术发展，我们能够对动物的钙信号变化进行实时检测。利用遗传编码的钙指示剂可以实现在体细胞内钙活动的可视化。研究人员可使用工程化的荧光蛋白，标记特定细胞类型的神经元，通过记录荧光信号的变化来反映细胞内钙离子浓度的变化，进而表征神经元的活动。

       接下来我们就一起来看看这三种体内钙信号记录方法的优缺点。

A双光子钙成像、B微型显微镜（单光子钙成像）、C光纤记录法

双光子钙成像

       在过去，大多数的体内钙成像是在双光子显微镜下完成的。双光子显微镜是一种荧光成像技术，其中两束相干激光通过显微镜的目镜聚焦到一个由点扩散函数定义的点上，类似于共聚焦显微镜选择性地激发类荧光分子。双光子显微镜和共聚焦显微镜的主要区别在于光吸收和荧光发射的物理过程。

优势

       在双光子显微镜中，激发光波长在700-1000nm附近，接近红外光谱。这是体内双光子成像的diyi个优势：长波长的光在组织中的散射更少，穿透深度更大。

       其次是具有良好的分辨率，不仅允许单个神经元可视化，而且可以看到亚细胞结构轴突末端的钙活动。

劣势

       双光子显微镜中的激光扫描技术也用于检测体内成像时神经元的快速钙动力学。使用激光扫描时必须考虑到不同采样率可能发生的光漂白的强度，区分信号和噪声的激发光强度通常需要足够高，会引起一定程度的漂白，光漂白超时会对图像质量产生负面影响。

       双光子显微镜在成像深度方面受许多因素制约。可以植入微型内窥镜（梯度折射率（GRIN）的透镜）使更深部的脑区可视化，但是由于物镜的大小，大部分皮层或其他脑区结构经常需要被完全移除来为透镜植入留出空间，这样可能会严重影响动物的行为。因此，当使用双光子显微镜进行成像时，选择大脑表面层作为研究区域是非常有利的，因为损伤Z小，分辨率更高。

       双光子显微镜体内钙成像的另一个缺点是由于物镜的大小，动物必须被头部固定。目前实验者通过使用圆柱形或球形跑步机使得动物能够稍微自由移动，或者通过一个虚拟现实场景进一步实现动物自由移动。然而，这种虚拟现实加头部固定成像的方法，已经遭到许多科学家的质疑。人们认为，头部固定的动物在实验期间一直处在物理约束和情绪压力下，因此无法证明神经元对外界的响应在虚拟现实和自由探索下是等价的。更重要的是，许多社会行为，比如亲子护理，交配和战斗，都不能用头部固定的实验来研究。

微型显微镜

优势

       基于微型显微镜的单光子活体钙成像，研究人员可以记录自由活动动物的钙信号。该微型显微镜通过与梯度折射率（GRIN）的透镜连接，可完成长时间内群体神经元活动的观察。这种、装置体积小，可以固定在动物头上，不会严重阻碍其运动。这项技术的发展使得微型显微镜成为研究发育、神经可塑性和神经退化性疾病的一种非常有用的工具。

劣势

       尽管使用微型显微镜在自由活动的动物中进行钙成像有很强的实用性，但这种方法仍存在一定局限性。与双光子相比，单光子成像背景荧光更高，并且更容易发生光散射。并且在某些行为学实验在应用受限，比如水迷宫和强迫游泳实验。此外，由于GRIN透镜植入物的直径范围为0.5mm~1mm，不可避免地会造成一定范围的组织损伤，这可能会影响研究的关键回路。

光纤记录法

优势

       光纤记录系统原理上主要分为荧光激发系统和收集系统，即向实验动物大脑特定脑区注射一定量的钙染料或遗传编码的钙指示剂，并在相同位置植入一根直径200-400μm的光纤，这根光纤既用于传送激发光，同时又可以收集发射光，收集到的荧光经PMT或CMOS传感器转换为电信号，随后经数据采集卡被传送至记录系统，以达到实时观察所研究脑区一群神经细胞钙荧光活动的目的。并且由于光纤探头的体积小和质量轻，研究人员可以同时对多个大脑区域进行记录。

       2014年，斯坦福大学的Karl Deisseroth教授实验室在发表的文章中首次命名了光纤记录（Fiber Photometry）技术，这种方法首次实现了动物行为与神经元轴突末梢钙活动的同时追踪，结合光遗传技术，阐明了腹侧背盖区-伏隔核的神经投射在编码和预测社交行为中的作用。基于遗传编码钙指示剂的发展，实验人员可以实现细胞类型特异性的标记，监测小鼠在完成复杂行为任务过程中一群特定类型细胞的平均活动。这种技术的出现对于编码社交行为、学习记忆和恐惧等行为以及病理状态下的回路水平神经信号的探测具有里程碑式的意义。

总结

       双光子钙成像具有较高的分辨率，单光子钙成像具有一定的机动性，但两种方法都存在一定的局限性。双光子需要动物头部固定，并且只能成像大脑表层轴突末端的钙活动。微型显微镜虽然能成像细胞体，但需要植入直径为0.5 - 1mm的GRIN透镜，这必然会造成组织损伤。而光纤记录法的局限是无法监测单个细胞的活动，只能检测光纤探针附近的群体神经元钙信号。

       尽管如此，研究人员通过双光子钙成像、单光子微型显微镜和光纤记录法，可以从不同空间尺度上观察细胞钙信号的变化，揭示钙活动在神经科学研究中的重要意义。

参考文献：Kasey S Girven, Dennis Ryan Sparta. Probing deep brain circuitry: New advances in in vivo calcium measurement strategies[J]. ACS Chem Neurosci. 2017 Feb 15;8(2):243-251.

Gunaydin LA, Grosenick L, Finkelstein JC, et al. Natural neural projection dynamics underlying social behavior[J]. Cell, 2014, 157(7): 1535-51.

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