请各位朋友们帮我分析下 我以前PCR扩增一个基因的CDS，长度1200bp左右，梯度摸好温度Z佳为50度，然后我扩增了20个样本，结果都很好，全部送出去双向测序，序列blast也对了，峰图也挺好的，可是现在再用同一条件就是扩增不出来了，重新摸了温度也解决不了问... 请各位朋友们帮我分析下
我以前PCR扩增一个基因的CDS，长度1200bp左右，梯度摸好温度Z佳为50度，然后我扩增了20个样本，结果都很好，全部送出去双向测序，序列blast也对了，峰图也挺好的，可是现在再用同一条件就是扩增不出来了，重新摸了温度也解决不了问题，体系也进行了优化，dNTP，引物，模板的用量我都进行正交优化了，还是没用。很巧妙的是在一次摸条件（混合模板）的时候56度跑出来了，而且非常亮，紧接着同样条件然后扩增一批，结果目的条带什么都没有，真的不解，稳定咋这么差，我这批模板做了10来个其他基因都是一次就能跑出来，测序结果都很好，模板没问题，这个基因的CDS引物我又重新合成了一次还是不行，所用的酶都试了好几种，MIX也用了，都无济于事。你们觉得我是重新设计引物还是咋的？但是这对引物跑的前面我20个测序结果都出来了，所以不想再换了，真的恼火，请大虾们帮帮小弟 万分感谢
我觉得根据你说的，就有一种可能啊，就是你的模板降解了。这个基因比较难扩增，所以对模板的要求比较高。引物应该很少降解，而且你以前也做出来了。
我建议你除了引物和模板全部换成你们隔壁实验室的试剂，连pcr仪Z好也用别人的试试，因为什么都有可能坏，而且你trouble shooting的时候没有做positive control，怎么知道不是你的dNTP或者polymerase坏了，所以之后的实验一定要做positive control。如果还不行，重新制备模板，引物一般没有问题，祝你成功
好吧，照你说的，每个环节都没有问题了，那估计是引物的问题了，但是我没有碰到过这样的情况，所以没有感性认识啊，照常理说，什么东西都一样，出来的结果不同，想不通。。。
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