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细菌全基因组提取求助

144613a 2017-01-02
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大大拿0
细菌基因组DNA的提取方法综述,提供了五种方法。

一、快速微量提取法
A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min, 丢去上清夜,收集菌体。
B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。
C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。
D.取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。
E.加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4℃保存备用。

二、蛋白酶/SDS法制备
先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.,第二天4000rpm离心10min收集菌体,用Washing TE(50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0)洗菌体2次,之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中,先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS,轻轻混匀后50℃放置3h~5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,氯仿抽提一次后,乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中,70%乙醇洗2次,干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。

三、
1) 细菌培养:细菌接种于5ml液体培养基中,37℃摇床(300rpm)培养过液。
2) 细菌收集:取1ml培养物于1.5ml EP管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中(用ddH2O也行)。
3) 菌体裂解:加入6μl 50mg/ml的溶菌酶,37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS 110μl,20mg/ml的蛋白酶K 3μl,50℃作用3h或37℃过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)
4) 抽提:菌液均分到两个1.5ml EP管,加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很粘稠,吸取时应小心,Z好枪头尖应剪去)
5) 沉淀:加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。1 2000rpm离心10min。
6)洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。
7) 抽(凉)干后,溶于50μl ddH2O中,取2-5μl电泳。作PCR模板用。

四、DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL
1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.
2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.
3) Freeze cell suspension at -20C
4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.
5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.
6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.
7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).
Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.
8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.
9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).
10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.
11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.

五、
1) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
2) 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。
3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
5) 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
6) 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7) 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟,沉淀DNA。
8) 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。
9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。
注:1)CTAB/NaCl溶液:4.1g NaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
  2)氯仿:异戊醇(24:1),酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),异丙醇,70% 乙醇,TE,10% SDS,蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂),5mol/L NaCl。

本方法通过SDS裂解细胞,蛋白酶降解蛋白,CTAB去除多糖成分一:仪器:同方法一 二:试剂:TE、TAE缓冲液;10%SDS;5MNaCL;20mg/ml蛋白酶K;CTAB/NaCL溶液(10% CTAB,0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中,缓慢加入10gCTAB,加热溶解);25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇;异丙醇;70%及乙醇三:操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心,5000rpm,1min 沉淀 溶于500μl TE缓冲液中混匀 30μl 10%SDS,3μL蛋白酶K,混匀,37℃,1小时 100μl NaCL(5M) 混匀 80μl的CTAB/NaCL,*混匀;65℃ 10min(可不做) 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,离心12000rpm,4-5min 取上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。注意 1,*此步操作后,离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M,否则DNA将与CTAB共沉淀。 2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,可以获得较为完整的DNA分子。
18 0 2017-01-03 0条评论 回复
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