水煮法提取DNA
【试剂】
缓冲液和溶液:用于筛选质粒的抗生素;氯霉素( 34mg/ml );选用:乙醇;异丙醇(PH8.0)
酶和缓冲液:溶菌酶( 10mg/ml );限制性内切核酸酶
凝胶:琼脂糖凝胶
【实验操作过程】
1、将500ml 培养物的细菌沉淀物重悬于用冰预冷的10mlSTET【(0.1mol/L NaCl10mmol/L
Tris·Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH 8.0)】中。将悬液移入50ml锥瓶中。
2、加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉淀于10mmol/L
Tris.Cl(pH8.0)]。如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地发挥作用。
3、用一个夹子把锥瓶放在酒精灯的明火上加热,直至液体恰好开始沸腾,不停地摇晃锥瓶。
4、立即把瓶浸入装有沸水的大烧杯(2L)中,将瓶放在沸水中,时间恰为40s。
5、将瓶浸入用冰预冷的水中5min,使之冷却。
6、将粘稠状内容物从瓶中转移到超离心管,于4℃以30
000rpm离心30min。原有的细菌物生长得越密,应越难将粘稠状裂解物转移到离心管中。必要时,可用长刀片和剪刀将裂解物剪成大小适于操作的大团块,或抽入10ml注射器的针筒中使之部分剪切。从用氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒DNA时,一般不会出现这样的问题。如果细菌碎片没能形成紧密的团块,可以以35000rpm再度离心20min,然后尽可能将上清转移到另一管内,弃去残存在管内的粘稠状液体。
7、将上清转移到另一管内,纯化质粒DNA。
【原理】
将细菌悬浮在含有能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中,然后加热到100℃使其裂解.加热除了能破坏细菌外壁,还有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA变性.但是闭环质粒DNA链彼此不会分离,这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构.当温度下降后闭环DNA的碱基又各就各位,形成超螺旋分子.离心除去变性的染色体DNA和蛋白质,就可以从上清中回收质粒DNA。