行为学实验手册丨学习记忆之恐惧记忆（2）

上一期，我们通过了解动物恐惧记忆相关的两种研究——穿梭实验与跳台实验，探究了通过特定的场景刺激（强光、电流和声音等）使小鼠产生恐惧记忆，经过一定时间强化后，环境与刺激两者被小鼠联系在一起，当小鼠再次回到该环境中便会出现恐惧相关行为的两种实验流程。

本期，我们将继续介绍两种研究小鼠恐惧记忆的测试——避暗实验与巴恩斯迷宫实验，探究动物大脑储存恐惧记忆的奥秘。

避暗实验

01.原理

利用鼠类的嗜暗习性设计，主要测试动物对明暗辨别觉的学习记忆能力。动物由于嗜暗习性而偏好进入和停留在暗室，当动物进入暗室或停留暗室时则会受到电击，动物为了避免受到电击伤害就会寻找安全区（明室），经几次反复后，ZZ记住安全区域。

02.实验材料

03.实验方法

适应期

实验开始前3-7天，每天抓取、轻抚动物，让其适应被实验人员抓取，避免实验过程中因实验人员抓取而造成动物处于应激状态，造成实验结果不可靠的问题。

建模期

① 时间：第 一天② 强度：

• 大鼠：电流：0.65-1.8mA（推荐0.8mA），或，电压65-70V。

• 小鼠：电流：0.15-0.6mA（推荐0.25mA），或，电压30-36V。

③ 频率：5-15Hz电流。

④ 刺激方法：实验开始前，将动物放入暗箱，适应5分钟。随后对暗箱进行通电，持续5分钟，此时明箱底部没有通电。

测试期

① 时间：第二天② 方法：将动物放进明箱，不进行通电，记录5分钟。

04.数据分析

①物活动轨迹，动物第 一次进入暗箱的时间（潜伏期），分别在两个箱体的活动时间，活动距离。

② P<0.05认为具有统计学显著性差异。

05.注意事项

• 选择体重均匀动物进行实验，测试时大鼠体重需<300g，确保体重不影响电击效果。

• 不同品系动物本身会有区别，常规推荐使用C57BL/6J小鼠和SD大鼠。

• 实验前后注意清理电击栅栏中的动物排泄物（排泄物会影响通电性及损坏电发生器）。

• 环境清理，通过酒精擦拭、晾干尽可能去除上一只动物气味，仪器设备具有通风性。

巴恩斯迷宫实验

01.原理

1979年，Barnes 建立了巴恩斯迷宫，与水迷宫和放射臂迷宫类似，它是基于啮齿类动物天生的探索特性，应用噪音、强光和暴露的开放环境作为应激手段，促使动物寻找目标洞。经过训练，动物学习并记忆目标箱的位置。该实验的优点在于对动物的应激性刺激较小，既不像放射臂迷宫那样需要禁食，也不像水迷宫那样应激性强。因此，在记忆研究中较为常用。尤其适用于与应激相关的记忆研究以及基因敲除小鼠的行为表型研究。

02.实验材料

巴恩斯迷宫，smart3.0

03.实验方法

① 实验开始前3-7天，每天抓取、轻抚动物，让其适应被实验人员抓取，避免实验过程中因实验人员抓取而造成动物处于应激状态，造成实验结果不可靠的问题。

② 实验第1天，将动物从目标孔洞放入目标箱内适应4分钟（只进行这一次）。

③ 实验第2-7天，将动物移动至平台中 央，用透明圆筒限制活动5秒，后撤掉圆筒开始计时，同时给与动物刺激（强光，声音等）。

• 动物成功进入目标箱，则让动物在目标箱内停留30秒。

• 若动物4分钟内没有找到目标箱，则诱导动物进入目标箱，停留30秒。

④ 随机转动圆盘，使孔位与上一次实验不同，但目标箱的方位始终保持不变。每天重复2次上一步的实验流程。

04.数据分析

① 第 一次探究洞的潜伏期，到达目标洞的时间，每只动物的错误次数（探究一个错误的洞即视为错误一次）。

• 潜伏期仅做参考，潜伏期越短，说明动物学会了迷宫原理，记忆水平越好。

• 到达目标洞的时间越短，说明动物记忆水平越好。

• 动物错误次数越多，说明动物学会了迷宫原理，但没有记住目标箱的位置。

② 采用单因素方差分析（one way-ANOVA），当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法。

③P<0.05认为具有统计学显著性差异。

05.注意事项

• 每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味。

• 不同品系动物对此实验的偏好性有很大不同，建议使用C57BL/6J小鼠进行实验。

【参考文献】

Rosenfeld Cheryl S,Ferguson Sherry A,Barnes maze testing strategies with small and large rodent models.[J] .J Vis Exp, 2014, undefined: e51194.

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背景

1930年，Tolman 和 Honzik 应用14个单元Ｔ型迷宫，研究大鼠的潜伏学习（Latent Learning）。随着研究深入，多单元迷宫演变为目前应用的Ｔ迷宫。1939年，Dennis首次定义了大鼠在Ｔ迷宫中的自发交替（Spontaneous Alternation）行为，认为大鼠能够对探索过的臂产生内起YZ（Internal Inhibition），而进入没有探索过的臂，从而增加发现食物的机会。

原理

T/Y迷宫是一种评价空间记忆能力的行为实验方法，主要应用于动物的辨别性学习、工作记忆和参考记忆的测试。在本实验中，工作记忆主要指短期记忆，而参考记忆主要指长期记忆。工作记忆能力下降，可出现空间定位困难等症状，参考记忆能力下降可出现新知识学习能力下降等症状。实验过程中，动物对目标臂的选择基于动物记住上次探索过的目标臂，以及对整体实验流程的熟悉程度；可以通过不同的实验方法来测试动物工作记忆和参考记忆的完整情况。

实验材料

T迷宫、Y迷宫、Smart 3.0

实验方法

01.自发连续交替选择实验

此实验为运用T/Y迷宫进行的最简单最基础的行为学测试，主要用于研究动物空间工作记忆的完整程度。优点是实验周期短，仅一天即可完成全部实验。

• 时间

每次实验时间不高于2分钟，每只动物试验连续重复10次。

• 适应期

实验开始前（自己繁育小鼠 Handle 3天，外购动物 Handle 7天），每天抓取、轻抚动物，让其熟悉实验人员手，在实验过程中不会处于应激状态。

• 方法

关闭主臂门闸，将动物放在主臂10秒，打开主臂门闸开始计时，待动物四肢全部进入一个目标臂后，结束计时， 将动物放回主臂，关闭主臂门闸，进行下一轮实验；2分钟内没有进入任何臂，记录实验失败，进行取出放回操作，进行下一轮实验。

• 记录数据

（1）进入左右臂的潜伏期（从主臂进入左右臂所需的时间），每次进入的臂；

（2）潜伏期主要用于判断动物对此实验的积极性；

（3）动物连续进入不同臂N次（N≥3），记为N-2次成功；

（4）实际成功次数/ZD成功次数 计算出动物实验成功率，以此判断动物自发连续交替选择的程度 百分比越高，说明动物工作记忆能力越强。

• 注意事项

（1）此实验为连续实验，应完成一只动物试验后再开展另一只动物的实验；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）每只动物测量以及清理时间合计约25分钟，如需对动物进行给药，需要逐只给药，确保药物生效后再进行实验。

02.奖赏交替选择实验（主要运用于T迷宫）

此实验为运用T迷宫进行的较为常规的行为学测试，采用食物奖赏诱导动物完成相关行为，让动物逐渐学会实验规定的迷宫探索方式。主要用于研究动物参考记忆的完整程度。优点在于利用食物形成奖赏机制，动物会更配合完成整个实验。

适应训练

• 时间

实验第 一天和第二天，每日4次，每次间隔大于10分钟。

• 方法

将多只动物放入迷宫3分钟，让动物进行自行探索。

• 注意事项

实验前动物需要限食，动物体重降低至实验前85%-90%后方可进行实验，若动物表现出不喜好探索的现象，可以利用少量食物诱导探索。

强迫选择训练

• 时间

实验第三至六天，每日6次。

• 方法

将动物放入主臂，同时在左右臂随机一臂中放入少量食丸（如4粒），关闭另一臂的进入通道，使动物被迫完成摄食强化。

• 记录数据

主臂滞留时间。

• 注意事项

（1）每只动物每次实验应间隔大于10分钟；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）训练左臂与右臂获得食丸数量，次数应保持一致。

测试

• 时间

实验第七天开始，至对照组动物平均正确率达到85%结束。每天重复6次。

• 方法

（1）强迫动物从主壁进入一侧实验臂，获得更少量的食丸奖励（如2粒）；

（2）获得食丸后立即将动物移回主臂（总时间应小于5秒），限制活动10秒；

（3）同时开放两侧实验臂，动物将四肢移动进一个实验臂视为一次选择，结束一次实验：

① 若进入DY步进入过的臂，则无奖励，限制活动10s，记录一次错误选择，

② 若进入DY步未进入过的臂，则给与少量奖励，记录一次正确选择。

• 记录数据

正确选择，错误选择次数，主臂滞留时间：

（1）主壁滞留时间主要用于判断动物对此实验的积极性；

（2）根据正确选择，错误选择次数计算出每天的平均正确率；

（3）平均正确率提升越快，说明动物参考记忆能力越强。

• 注意事项

（1）每只动物每次实验应间隔大于10分钟；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）如需对动物进行给药，则仅在此测试阶段进行给药。

03.空间识别（主要运用于Y迷宫）

此实验为运用Y迷宫进行的较为常规的行为学测试，是根据啮齿类动物天生对未知事物有强烈的好奇心以及探索欲望的原理进行的。优点在于可以同时对动物的参考记忆和工作记忆进行研究，实验方式简单。

• 时间

（1）测试工作记忆，探索期与测试期建议间隔2小时；

（2）测试参考记忆，探索期可设置1-2天，隔天进行测试；

（3）同时测试参考与工作记忆，探索期与测试期间隔2小时，每天重复一次实验，持续进行5-7天。

• 方法

（1）适应期：实验开始前3-7天，每天抓取、轻抚动物，让其适应被抓出的环境；

（2）探索期：将迷宫的一个臂封锁，在一个臂远离中间的位置放置动物，让动物在其它两个臂自由探索3分钟；

（3）测试期：将迷宫封锁的臂打开，在与探索期相同的位置放置动物，在让动物自由活动3分钟。

• 数据记录

（1）总活动路程，未开放臂进入潜伏期，每个臂滞留时间及路程，进入每个臂的次数；

（2）总活动路程仅作为参考，排除一些无运动意愿动物的数据；

（3）潜伏期越短，说明动物记忆力越好；

（4）进入未开放臂的时间越久，运动路程越长，进入次数越多说明动物记忆力越强；

（5）同时测试参考与工作记忆时，每次试验中放置动物的位置应保持一致，记录动物在测试期进入另外两个臂的时间比例。正常动物实验初期进入未开放臂的时间比例可达到80%，随着实验时间的增加，比例逐渐降低至50%左右。工作记忆受损的动物在实验开始时进入未开放臂的时间比例就接近50%左右；参考记忆受损的动物进入未开放臂的时间比例则会一直维持在一个较高的水平。

• 注意事项

（1）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（2）如需对动物进行给药，则需要在探索期就进行给药。

04.数据分析

常规方法是采用单因素方差分析（one way-ANOVA）；当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法，P<0.05认为具有统计学显著性差异。

【参考文献】

1. Deacon Robert M J, Rawlins J Nicholas P, T-maze alternation in the rodent.[J]. Nat Protoc,2006 , 1 : 7 - 12. （IF：13.493）（自发交替和奖赏交替）

2.Hughes Robert N,The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory.[J] .Neurosci Biobehav Rev, 2004, 28: 497-505. （IF：8.33）（自发交替与空间识别）