RNA的提取方法

实验三 酵母RNA的提制（浓盐法）
一、目的
学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。
二、原理
酵母含 RNA 2.67％～10.0％，DNA很少（0.03％～0.516％），而且菌体容易收集，RNA也易于分离，所以选用酵母为实验材料。
RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度Z小的性质，将pH调至2.0～2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。
提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细胞壁，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA在此条件下不稳定，容易分解；后者在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。
三、仪器、试剂和材料
1．仪器
（1）量筒（50ml）
（2）三角瓶（100ml）
（3）烧杯（250ml，50ml，10ml）
（4）布氏漏斗（40mm）
（5）吸滤瓶（125ml）
（6）表面皿（6cm）
（7）751型分光光度计
（8）离心机（4000r／min）
（9）恒温水浴
（10）药物天平
（11）烘箱
2．试剂
（l）NaCl（化学纯）
（2）6mol／L HCI
（3）95％乙醇（化学纯）
3．材料
鲜酵母或干酵母；pHO.5～5.0的精密试纸。
四、操作步骤
1．提取
称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。
2．分离
将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。
3．沉淀RNA
将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时，用6mol／L HCI 小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
4．洗涤和抽滤
上述悬浮液以 4000r／min离心 10min，得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内，用95％的乙醇 5～10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次。
5．干燥
从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。
6．含量测定
将干燥后RNA产品配制成浓度为 10—50pg／ml的溶液，在751型分光光度
计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA含量：

式中，A260为260nm处的吸光度；L为比色杯光径（cm）；0.024为lml溶液含lμg
RNA的吸光度。
五、结果处理
根据含量测定的结果按下式计算提取率

六、注意事项
1．用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度，避免在20～27℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。
2．加热至90～100℃使蛋白质变性，破坏两类磷酸酯酶，有利于RNA的提取。

**我们实验室一个师兄才做过，效果挺好

ls的乱贴什么杂七杂八的东西。
也不整理整理

我本科毕业论文做过酵母RNA的提取，用液氮研磨破壁，用TRI REAGENT对酵母中的总RNA进行提取，这些东西随便找本分子克隆技术的书里面就有，或者上丁香园也可以找到。以下是我的实验步骤，供参考。
TRI REAGENT法提取RNA
1.取菌液20mL，分装于10mL离心管中，平衡后，3500rpm离心5min；
2.倒去上清，PBS洗涤1次，3500rpm离心5min；
3.倒去上清，PBS洗涤1次，4℃，12000rpm离心1min；
4.重复步骤3洗涤1次；
5.倒去上清，将沉淀移如研磨缸中，加入液氮研磨4次；
6.将粉末移入两只新离心管中，分别加入1mL TRI REAGENT试剂，静置5min；
7.加入200mL 氯仿，摇动15s，静置10min；
8.4℃ 12000rpm离心15min，取上清至新离心管中；
9.加入500μL异丙醇，静置8min；
10.4℃ 12000rpm离心15min，吸出上清，加入75%乙醇洗涤3次；
11.加入75%乙醇， -70℃保存。