分子生物学实验基本操作规程

第3章 分子生物学实验基本操作技术

这里的实验基本操作技术是指在分子生物学实验中使用范围Z广、使用频率Z高、几乎所有实验都要应用的技术。器皿的清洗，试管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、电子天平等量具的正确操作和使用、试剂配制等技术，应当都是基本操作技术，但这些内容已在分析化学、生物化学的实验课程中作了详细介绍。本章主要介绍与分子生物学实验有关的除（灭）菌技术、无菌操作技术和微量操作技术。
3.1 除(灭)菌技术
在进行分子生物学实验过程中，需要一个清洁的实验环境，所使用的器皿及溶液均需要进行除（灭）菌处理，一方面避免环境中微生物的污染，另一方面还可消除蛋白酶和核酸酶对实验的干扰和影响。在进行微生物及细胞的纯培养时要求更高，不能有任何外来杂菌。因此，对所有器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，保证工作顺利进行。
实验室常用的除灭菌方法主要有物理方法及化学方法两种。物理方法包括用湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线、过滤、离心沉淀等方法除去微生物；化学方法是使用化学消毒剂、KJ素等杀死或YZ微生物。根据被灭菌物品的材料性质和实验要求，可采取不同的消毒灭菌方法。
3.1.1 物理灭菌法
（1）干热灭菌：干热灭菌包括火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。
火焰灼烧适用于金属用具，如接种环、接种针和手术器械等，玻璃器皿的口颈，如试管口和瓶口，玻璃棒等的灭菌处理。这种方法灭菌迅速彻底。
热空气灭菌一般在烤箱中进行，利用高温干燥空气（160℃170℃）加热灭菌12h，适用于玻璃器皿和培养皿等。干热消毒后的器皿干燥，易于保存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要求较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的。应当注意，干烤灭菌完毕后不得马上将烤箱门打开，须等温度降至70℃以下时再开箱门，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。在灭菌时，物品不能放的太挤。灭菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌时容易炸裂。培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此方法消毒。
（2）湿热灭菌：在相同温度下，湿热的灭菌效力比干热灭菌好。原因是：（1）热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；（2）热蒸汽比热空气穿透力强，能更有效地杀灭微生物；（3）蒸汽存在潜能，当气体转变成液体时可放出大量热能，故可更迅速提高灭菌物体的温度。
湿热灭菌常用的方法有高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌和煮沸灭菌。其中高压蒸汽灭菌法Z为常用，效果Z好。常压蒸汽灭菌法不能在短时间内杀死细菌芽孢，必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，才能达到完全灭菌。而煮沸灭菌仅用于注射器及某些用具的灭菌，被灭菌物品的湿度太大。所以，这两种方法较少使用。
高压蒸气灭菌是在密闭的高压蒸汽锅中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，将锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而使温度也随之上升到100℃以上。
灭菌时，根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是0.15MPa下15min，培养液和橡胶制品为0.1MPa下10min。灭菌前在锅内加适量的水，加水过少，易将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物品浸水。物品不能装得过满，以免影响消毒器内气体流通。导气管要伸至罐底并防止堵塞。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，开始升压，当达到所需压力时，开始计时，并控制压力恒定。灭菌过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止意外事件发生。灭菌完毕后一定要先打开阀门放气，当灭菌锅内压力下降到“0”时，再打开灭菌锅的盖。也可在灭菌完毕后，关闭电源总阀，让灭菌物品自然冷却，待灭菌锅压力表降至“0”时，再取出灭菌物品。

蒸汽压力与温度的关系
蒸汽压力（表压） 蒸汽温度
Kg/cm2 MPa ℃ ℉
0.00 0.00 100 212
0.25 0.025 107.0 224
0.50 0.050 112.0 234
0.75 0.075 115.5 240
1.00 0.100 121.0 250
1.50 0.150 128.0 262
2.00 0.200 134.5 274

（3）紫外线杀菌： 紫外线的波长范围是200300nm，杀菌范围为240280nm，其中波长在260nm左右的紫外线杀菌作用Z强。紫外灯是人工制造的低压水银灯，能辐射出257.3nm的紫外线，杀菌能力强且较稳定。紫外线杀菌作用是因为它可以被蛋白质（波长为280nm）和核酸（波长为260nm）吸收，造成这些分子的变性失活。紫外线穿透能力很差，不能穿透玻璃、衣物、纸张和大多数其他物体，但能穿透空气，主要用于实验室空气、操作台表面和不能使用其它方法进行灭菌的物品。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌。培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒物品不宜相互遮挡，照射不到的地方起不到消毒作用。
紫外线照射可产生臭氧，污染空气，对试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害。
（4）过滤CJ：很多液体不能采用高压灭菌的方法进行灭菌处理，如血清、合成培养液、酶及含有生物活性蛋白的液体等，可采用过滤的方法除去细菌等微生物。滤器有抽吸（抽滤）式及加压式两种类型；滤板（或滤膜）结构可分为石棉板、玻璃或微孔膜。常用的滤器有Zeiss滤器（蔡氏滤器）、玻璃滤器和微孔滤膜滤器，其中微孔滤膜滤器Z为常用。
微孔滤膜滤器多为塑料结构，分为上下两部分，中间可放置纤维素滤膜。将待过滤液体吸入注射器内，慢慢注入滤器上部的孔中，通过中间的滤膜即可。可用于包括血清在内的各种培养液的过滤CJ，速度快，效果好。滤膜为一次性的特制混合纤维素滤膜，其孔径有0.6μm、0.45μm、0.22μm三种，用于过滤CJ时，Z好选用0.22μm的滤膜（可以除去细菌和霉菌）。安装滤膜时要注意：先将滤膜在蒸馏水中浸湿再安装；滤膜薄且光滑，容易移动，千万不能装偏而使过滤失败；同时要注意滤膜的正反面，正面（光面）应朝上。由于滤膜薄，承受压力有限，压力不能过大、过猛，以免造成滤膜破裂。每次过滤后应打开滤器，核实滤膜是否移动和破裂，以保证有效过滤CJ。微孔滤膜滤器的清洗、消毒方法很简单，用完后去掉滤膜，用去离子水冲洗干净，再将新的滤膜正确放入其中，包裹后可高压灭菌处理，也可直接煮沸灭菌处理。现在也有一次性小滤器。
3.1.2 化学灭菌法
应用化学制剂破坏细菌代谢机能。常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、、高锰酸钾、新洁尔灭等。Z常见的是75%酒精及1‰的新洁尔灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学灭菌法操作简单、方便有效。
将高锰酸钾粉末与适量体积的混合，会产生大量的甲醛气体，常用于无菌室的熏蒸消毒。
3.1.3抗生素灭菌法
主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。要注意不能完全依赖抗生素来达到消毒灭菌的目的，还应严格无菌操作。常用的抗生素是青霉素和链霉素。
3.2无菌操作技术
无菌技术是指实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法，是实验过程中预防和控制交叉污染的一项重要基本操作。在生化实验中经常涉及到无菌操作技术，尤其是微生物的纯培养、细胞及胚胎的培养，更需要严格的无菌操作技术。在无菌操作过程中，任何一个环节都不得违反操作原则，否则就可能造成实验失败。因此，必须加强无菌观念，准确熟练地掌握无菌技术，严格遵守无菌操作规程。
无菌技术包括四部分内容：实验所用的玻璃、塑料制品及金属器械的处理；实验操作对象及试剂的无菌处理；工作环境及表面的处理；实验者的操作技术。前两部分已在前面介绍过，这里主要介绍后两部分内容。
1. 周密计划 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。
2．仔细准备 根据实验要求，准备各种所需的器材和物品，并选择适宜的方法进行包装和除（灭）菌处理，清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净工作台)内。这样可以避免开始实验后因物品不全往返拿取而增加污染机会。
3．严格操作
实验进行前，无菌室及超净工作台以紫外灯照射3060min灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10min后，再开始实验操作。实验操作应在超净工作台的ZY无菌区域，不要在边缘的非无菌区域操作。
为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于ZY。
在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精擦手或用消毒液洗手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入细胞培养室需彻底洗手，戴口罩、着消毒衣帽及鞋等。
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在火焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能夹取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞或微生物的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞或微生物。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。进行无菌操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备用品更换。
工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养用液及其他溶液在未用前，不要过早开瓶；打开瓶盖进行操作时，瓶口朝上与台面呈45度角，减少落菌机会；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。吸取营养液、PBS缓冲液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防影响试剂的效果、扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作台讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口Z易污染，加液时如吸管尖部碰到瓶口，则应更换干净吸管。
对于微生物或细胞而言，每次操作只处理一种微生物或一个细胞株，即使培养基相同也不要共享培养基，以免微生物或细胞间污染。
4．善始善终 实验完毕后，应及时将实验物品及废液带出工作台，关闭风机，以70%酒精擦拭无菌操作台面，关闭超净工作台的风机和照明灯，实验结束。尽管每次实验前都会进行工作台面的消毒处理，但建议实验结束后立即打开紫外灯进行消毒，特别是在夏季，以防细菌或霉菌孳生。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其他实验用品用完即取出，以利于空气流通。
3.3微量操作技术
在过去的实验中，大家使用的重量和体积计量单位主要是克（g）和毫升（ml）及其以上者，而小于g和ml的单位如毫克（mg）、微克（g）及微升（l）等极少用到。从进入分子生物学实验开始，这些很小的计量单位都将经常使用，甚至更小者如纳克（ng）、皮克（pg）及纳升（nl）等也将用到。由相对宏观的操作突然转为微量操作，对初学者来讲需要有一个熟悉并熟练的过程，关键应当注意以下几个方面的问题。
1. 熟悉并掌握微量称量器具的正确使用方法。微量电子天平（Z小感量10-4g）和微量移液器（Z大2l）是两种Z常使用的器具，它们的使用方法请参考第2章有关内容。准确量取是微量操作的diyi步，也是Z重要的一步。
2. 添加。将一种或几种液体物质分别准确量取后添加到同一个Eppendorf管中，必须保证看到每一种液体都加入其中，而且在取出移液器时，Tip头的尖部不得带出任何可见的液珠。
3. 混匀并集中。全部液体加完后，总体积只有10到几十微升，难以用常规混匀的方法将各种成分彻底混匀。微量混匀的方法有：旋涡震荡混匀和弹匀。将盛有液体的Eppendorf管盖紧，握紧并将其底部与旋涡震荡器接触，液体会在管内高速旋转而混匀；也可手持盖好的Eppendorf管上端（口部），另一只手反复弹动其底部，将其中的液体混匀。Z后，用高速台式离心机将全部液体甩到Eppendorf管的底部。
4. 有时将极微量的物质如DNA片段或质粒DNA溶解在几微升液体中，尽管看不见待溶解物质，但将液体加入后，用上述同样的方法进行操作，也可很好将其溶解并混匀。
5. 由于微量操作，实验结果很难用肉眼直接观察到。为了保证实验的顺利进行，在分子生物学实验过程中，每一步实验的结果都必须利用相关的检测、鉴定方法显示出来，判定正确后再进行下一步反应。这是所有科学实验的共同要求，但在分子生物学实验中更应当强调和加以注意。

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