1.初步提纯 (差速离心): 将上述组织匀浆液于4°C 3500g 离心15min,
取上清液,以缓冲液TEN 重悬沉淀物,反复离心2-3 次。弃沉淀,合并上清液,加入蔗糖配制成终浓度为25%(w/w)的蔗糖垫,于4°C 45000g 离心1.5h。弃上清,以25%(w/w)蔗糖/TEN 重悬沉淀物。
2.分散病毒粒子:分散在4°C 冰箱中用磁力搅拌重悬物过夜,使重悬液分散均匀。
3 .进一步提纯(蔗糖密度梯度离心):以TEN 配制蔗糖梯度(30%、35%、
40%、45%、50%、55%,w/w),加铺上述重悬液于离心管管顶。于4°C 125000g 离心4h,收取蔗糖梯度中乳白色或浅褐色沉淀带,(如沉淀可加大密度梯度范围)吸取带附近糖液测糖密度。
4.病毒回收:以TE(0.05M Tris-HCl,0.01M EDTA , pH 7.8)稀释。于4°C 45000g 离心1.5h 去除蔗糖,以TE 重悬沉淀物,-70°C 保存备用。电镜观察纯度和形态。
5.根据结果调整离心步骤的细节。