通变性剂破碎细胞或者组织经氯仿等机溶剂抽提RNA再经沉淀洗涤晾干溶解由于RNA酶处随能RNA降解所实验需要注意稍疏忽前功尽弃0T3z(F&_，D6c%^"h6YA6_RNA提取般步骤-O:Y+x$p#s8U4M9S所RNA提取程都五关键点即：品细胞或组织效破碎；效使核蛋白复合体变性；内源RNA酶效YZ；效RNADNA蛋白混合物离；于糖含量高品牵涉糖杂质效除其关键YZRNA酶性RNA提取目前阶段主要采用两种途径:提取总核酸再用氯化锂RNA沉淀；直接酸性条件抽提酸性DNA与蛋白质进入机相RNA留水相第种提取导致量RNA丢失目前该使用频率已低(O(g;^+K)f+i&]%P实验步骤：*l&d6s5e(q1F(g2|j，^0s破碎组织→离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA6D8}.Q;Y，g*X1、破碎组织灭RNA酶同步进行用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织加入β-MEYZRNA酶性"s%f，`0[1d*m!]0e2、离RNA般用酚、氯仿等机溶剂加入少量异戊醇经步离RNA般布于层与蛋白层&X.P)i)Y;L#u/[3、沉淀RNA般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇2@0d&z7?+i，g1@4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤避免RNA洗掉步省掉洗涤晾干或者烤干乙醇能于干燥否则易溶解3@%V"o9v+I1J2o9k"z5、融解RNA般使用TE;L5f.n6}(S1t%Z&J6、保存RNA应该尽量低温防止痕量RNase污染富含RNase品（胰脏、肝脏）离RNA需要贮存甲醛保存高质量RNA于期贮存更鼠肝脏提取RNA水贮存星期基本降解鼠提取RNA水保存3仍保持稳定另外度于4kb转录本于痕量RNase降解比转录本更敏增加贮存RNA品稳定性RNA溶解离甲酰胺存于-70℃用于保存RNA甲酰胺定能含降解RNA杂物源于胰脏RNA至少甲酰胺保存准备使用RNA使用列沉淀RNA：加入NaAc至0.3M12，000×g离5钟&P3[7m*^$U$_"?:F"xu*N(?(I氯化锂提取总RNA："u;}'I!r'^'^&l本用高浓度尿素变性蛋白并YZRNA酶用氯化锂选择沉淀RNA其特别适合于量品提取少量组织RNA具快速简洁处存少量DNA污染及RNA率高，RNA片断丢失缺陷#~*S:}9`*r4Z3P试验试剂："d$r6Q+_.I8Q1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L滤灭菌】7_8w1t"o9a'q!i4Z2、悬浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6)，1mM?EDTA(pH8，0)，0.5%SDS】!m8Q4R，]&y:b#`7d试验步骤：7[6?$`*};o7_Z'{1、于量组织或细胞则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液匀桨器高速匀桨2钟；于少量细胞（107细胞/ml）则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨并转移至Eppendof管&Y)b:E，Q"l/^Q:\$s2、匀桨液0－4℃放置412000g离30钟x-C6D-N/N0K!t2a3、取沉淀加入原匀桨液1/2体积氯化锂－尿素溶液重复步骤2)y-x)S0K9y6j，e4、沉淀用原匀桨液1/2体积氯化锂－尿素溶液复溶加入等体积酚/氯仿/异戊醇室温放置15－30钟并摇混匀4000g离5钟3d2v'i1~(~*D5、取层水相加1/10倍体积3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积乙醇－20℃放置15000g离L4a'Q4u"l:a*K%Z$?(e6、70％乙醇洗沉淀真空干燥3};r0[/Q'G9q7、RNA溶解液溶解沉淀RNA装于－70℃保存0f.X%R(H%B7g!y7j5u$C'|)[%~!J3D:Q蛋白酶－热酚6|"^0b*[)P3S*c4b4H4l本适合于病毒RNA提取*I(i+b#r!K试验试剂：$?4[7H9`)J1、蛋白酶K（终浓度50ug/ml），J5pl6V/t7[/I2、2×缓冲液：1%SDS?20mMTris-HCL(pH7.6)?0.2MnaCL9h，p]y+\$Z)O试验步骤：#W3v8G1[$]5y1、提纯病毒液加入等体积缓冲液、蛋白酶K，37℃40-50钟-K0p/E'G0M#Q-z7n，{#d2、加入等体积65℃预热酚溶液轻徭，65℃保温5钟再轻徭w!`;W(~，E:i3^3、离取清氯仿抽提，|(Z0d;j2@7m+d2Q&xH4、取层水相加1/10倍体积3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积乙醇－20℃放置15000g离(10000g，10min)7[/w，h2d6U$k5、70％乙醇洗沉淀真空干燥%A5Y;{(w%]3a*y，Oe)P6、RNA溶解液溶解沉淀RNA装于－70℃保存植物RNA提取程难点相应策植物RNA提取程难点相应策)o5B7d/Q3_酚类化合物干扰及策：a9D*Z3K?7W许植物组织特别植物实（苹、樱桃、李、葡萄等）树木类植物富含酚类化合物酚类物质含量随着植物增加幼嫩植物材料更容易提取RNA外针叶类植物针叶酚含量比落叶植物叶要高植物材料匀浆酚类物质释放氧化使匀浆液变褐色并随氧化程度增加加深现象称褐化效应（browningeffect）氧化酚类化合物（醌类）能与RNA稳定结合影响RNA离纯化Newbury等发现RNA提取难易程度与材料酚类物质总量间并相关性认所酚类化合物都影响RNA提取般认所谓缩合鞣质即聚合羟基黄酮醇类物质（原花色素类物质）影响RNA提取类化合物目前除酚类化合物般途径提取初始阶段防止其氧化再其与RNA9b0S!}0U6|9k/l!v"vg1~/@防止酚类化合物氧化："v;y，a4k7n/Z1、原剂：般提取缓冲液加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸防止酚类物质氧化提取液(-巯基乙醇浓度高达2％(-巯基乙醇等打断酚氧化酶二硫键使失Su等认夜沉淀RNA加入(-巯基乙醇（终浓度1％）防止程酚类化合物氧化硼氢化钠（NaBH4）种原醌原剂用处理提取缓冲液褐色消减醌类化合物原酚化合物&H.z.p+~&t%t5G&G1M-P/q!u2、螯合剂：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）CO－N＝基强结合酚化合物能力其结合能力随着酚化合物芳环羟基数量增加加强原花色素类物质含许芳环羟基与PVP或溶性PVPP形稳定复合物使原花色素类物质能酚氧化酶底物氧化并抽提步骤除用PVP除酚pH值重要影响素pH8.0PVP结合酚能力迅速降低〔11〕原花色素类物质量较单独使用PVPP除所类化合物需要与其结合使用p%N0w/t7r3、Tris-硼酸：提取缓冲液含Tris-硼酸（pH7.5）其硼酸与酚类化合物依*氢键形复合物YZ酚类物质氧化及其与RNA结合十效所Lбpez-Gбmez等提取缓冲液再加入其原剂Tris-硼酸浓度高（＞0.2M）则影响RNA收率#p8]0^8K3a4、牛血清白蛋白（BSA）：原花色素类物质与BSA间产类似于抗原－抗体间相互作用形溶性或溶性复合物减原花色素类物质与RNA结合机提高RNA产量BSA与PVPP结合使用提取效更由于BSA往往含RNase使用要加入肝素YZRNase性)~#H/y(P7Q)j4G*w1G8l5、丙酮：Schneiderbauer等用-70℃丙酮抽提冷冻研磨植物材料效云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物植物材料离高质量RNA@+?-X/V9z8T8H:B3C!W'C酚类化合物除：&z#h)G0H&]$I1N"f.l9N通Li+或Ca2+沉淀RNA未氧化酚类化合物除与PVP、溶性PVPP或BSA结合酚直接通离除掉或苯酚、氯仿抽提除Manning利用高浓度2-丁氧乙醇（50％）沉淀RNA酚溶解于2-丁氧乙醇除用含50％2-丁氧乙醇缓冲液洗涤RNA沉淀除残留酚认即使酚氧化其氧化产物仍溶解高浓度2-丁氧乙醇溶液除需再用NaBH4处理5C6Y8a1SV:`2~糖干扰及策：6I-b3R4~$T&O糖污染提取植物RNA遇另棘手问题植物组织往往富含糖糖许理化性质与RNA相似难除糖同RNA裹携走造RNA产量减少；沉淀RNA产糖凝胶状沉淀种含糖RNA沉淀难溶于水或溶解产粘稠状溶液由于糖YZ许酶性污染糖RNA品用于进步物研究规通SDS-盐酸胍处理部除些糖；高浓度Na+或K+离存条件通苯酚、氯仿抽提除些糖；通LiCl沉淀RNA部糖留清液即使通些步骤仍发现相糖与RNA混杂起所需要用更效解决植物RNA离纯化糖污染问题7['X/e，d8x(B-p(|9C&n用低浓度乙醇沉淀糖除糖效较RNA提取液或溶液缓慢加入水乙醇至终浓度10％～30％使糖沉淀RNA仍保留于溶液般都植物材料匀浆液加入乙醇Lewinsohn等裸植物木质茎提取RNA匀浆清液加入乙醇至终浓度10％沉淀糖Tesniere等葡萄浆组织提取RNA用CsCl超离乙醇沉淀RNA溶液加入终浓度30％乙醇沉淀糖进步纯化RNA品!i5b5m*z9G8M4~-N/D另用醋酸钾沉淀糖Bahloul等提取云杉组织RNA匀浆清液加入1/3体积5M醋酸钾（pH4.8）溶液沉淀糖；Ainsworth提取酸模植物花组织RNA加入1/5体积5M醋酸钾（pH4.8）溶液Hughes等提取棉花叶花粉RNA加1/3体积8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液匀浆液除糖等杂质提取某些植物材料RNA述两种结合使用Lбpez-Gбmez等提取芒皮RNA匀浆液加入0.25体积水乙醇0.11体积5M醋酸钾溶液除糖杂质Su等除褐藻糖单独使用乙醇或醋酸钾都效两者结合使用效佳6c9|5q1b9[5l1s+nFang等认缓冲液含高浓度NaCl助于除糖Chang等提取松树RNA缓冲液NaCl浓度2.0M1.0M通氯仿抽提乙醇沉淀RNARNA与糖离Manning胡萝卜种等材料苯酚提取清液稀释调节Na+离浓度至80mM加入0.4体积2-丁氧乙醇沉淀除糖3B1h#M'{+{0U%U，K2@，v蛋白杂质影响及策：$@-G5o(f1s9_2V*G2n/^蛋白质污染RNA品重要素由于RNase酚氧化酶亦属于蛋白质要获完整、高质量RNA必须效除蛋白杂质规冷冻条件研磨植物材料YZRNase等性；提取缓冲液含蛋白质变性剂苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等匀浆使蛋白质变性凝聚；利用蛋白酶K降解蛋白杂质进步用苯酚、氯仿抽提除蛋白质'T7v(F1J9@+EWilcockson利用蛋白质与RNA高氯酸钠溶液溶解度同离70％高氯酸钠溶液RNA溶解度于蛋白质溶解度部蛋白质沉淀接着离清液加入两倍体积水乙醇RNA能沉淀能溶于70％高氯酸钠溶液残留蛋白质仍留清液除绝部蛋白质3qe/\*I"A&@级代谢产物影响及策：:N3|)NfK#n;p'f6h0J2A0{植物组织提取高质量RNA另难点许高等植物组织尤其熟组织能产某些水溶性级代谢产物些级代谢产物容易与RNA结合并与RNA共同抽提阻碍具物性RNA离能确定些级产物具体物质所目前没特殊解决问题Baker等综合Hughes等选择性沉淀、Chirgwin氯化铯梯度离Iversen等RNA收纯化松树种、熟松树针叶等植物组织RNA(Ms5O%f!H-Q*\(m"`(}由于植物组织特别高等植物组织细胞内外组复杂性使植物组织RNA提取相于其物材料说要困难实践经发现即使同种植物同组织其RNA提取同；含某种干扰素同植物材料其适用RNA提取能同；即使同种植物同种组织材料源于同基型植株其RNA提取能所于某植物或其组织说其相应RNA提取必需经摸索实践才能确立#S0a#G7L3S&A随着植物物研究领域拓宽肯定说作其研究基础植物材料RNA提取程现新难点随着断探索经验积累科工作者定迅速解决些难点植物物发展铺平道路植物RNA提取些特殊植物RNA提取些特殊$e*[2U(E%h'[酚类植物RNA提取：!j!d，]2V(R!B&o苹棉花等酚类植物提取RNA用TRIZOL般提验证效，提取RNA纯度特别高，用作northern足够6j&d2u(\6W8_&o4E1X1t实验试剂：#s7s8H!R#W1y#g提取buffer200ml：NaCl1.1688g100mMTris2.4228g10mM(tris-HCl8.0)EDTA5.8450g10mMSDS2.0000g1%NaOH调至8.0，定至200ml，加200ulDEPC融解.*j)s;t2@)t4W'F试验步骤：!Ta0I*C(w5S"E*A'W1、1.5ml离管用液N2冷冻吼加入0.1g品，立即加入500ul酚氯仿，再加入500ul提取buffer，剧烈振荡1-2min，冰放置5min"F3S0V5@0s7i1T2、4度12000rpm离15min，清转入新管，加氯仿异戊醇抽提)H'L7d#d"y8@3、取600ul异丙醇，-20度沉淀20min.&w:m2r:I4\4l#J4、12000rpm离10min!I.Y.\8b7A5、沉淀用70度乙醇洗k!T.D1[0w+?)_0D5?6、8000rpm5min"A;y#}'F(`5}6I+N!x7、沉淀晾干，溶于30ulDEPC水;^0Q-R+`5j(n'['m9M#m/r3o2O!T6z$`1m&e.^银杏等木本裸植物RNA提取：&Ai&V!H0`?6R银杏、香机等木本裸植物酚类糖等物质含量较RNA离纯化干扰严重影响提取RNA质量产量给相关物实验进行带阻碍目前RNA提取采取规Trizol试剂盒、SDS等能提取银杏RNAShujunChang等(1993)CTAB提取RNA质量较差降解十严重其提取步骤进行改进质量较高银杏RNA品/s4i*Vk8S)x试验试剂：!]!M(q#E7N3t;`#i.m([1、1Mtris:12.11gTris溶于60mL水用浓盐酸调至Ph8.0定容至lOOmL.用灭菌DEPC水溶解`4c9{)p2\4t2、500mMEDTA:18.61gEDTA"H2O加入80mL水搅拌溶解用NaOH调pH至8.0定容至100mL;V#x*j!H4y!G4M#q3c5P3、10mol/LLiCL:42.4gLiCL，100mL水溶解即9i)@a'\&w+cp*g4、提取缓冲液(DEPC水处理):2%CTAB（蛋白质变性剂）.2%PVPK30（除酚类物质）100mMTris-HCL(Ph8.0)25mMEDTA（金属鳌合剂）2.0MNaCL（除糖CTAB）配:2gCTAB，2gPVP，10mL1mol/Ltris，5mL500mMEDTA，11.7gNaCL，定容100mL)o+\5E!X;O#A(M+P8H*K9n0q5、亚精胺(提取加少量)（RNA酶YZ剂）#J9g6O/h(u'd6、4%0疏基乙醇(提取加)（除酚类物质）'De，d(J.K$z!O9f7、氯仿异戊醇(24:1)（抽提蛋白质）)U)A+]4\#Q8、10MLiCL（沉淀RNA）7M+b)g4J4m5C0f-\9、SSTE（溶解RNA）1.0MNaCL0.5%SDS1mMEDTA(PH8.0)10mMTrisHCL(pH8）配:2.9gNaCL，0.25gSDS，0.5mL1Mtris，100uL500mMEDTA，pH8.0，定容至50mL.m5z+J3X0V&\6e7Y#R试验准备：;_5z9}"f%q6t1、研钵玻璃器皿用锡纸包200℃向温烘烤2或180*C高温烘烤4;X7n3w，W2}9M2、塑料制品(枪离管)用新并且用报纸包121'C高压灭菌灭菌40min或连续两121'C高压灭菌每灭菌20min用烘箱烘千;X*f+~，v7}.a3、所溶液配制加DEPC水使DEPCuJ浓度0.1%，37℃夜1211C高压灭菌40min.(其Tris能用DEPC处理所Tris用DEPC处理水溶液灭菌配制))x&B，{%e"^&F:s0q试验步骤："Y6U+`2C*\4X2a#r【根据文献(ShujunChang，1993)CTAB稍作改进】;F^+e9I#h/Q7m*A*]1、4mL提取液加入lOmL离管c卜650C水域加热$D+?4w7\3J:w，M2、用液氮冷却研钵研钵加入少量抗氧化剂PVP取1g低温冷冻银杏叶片迅速置于研钵加入液氮防止研磨程叶片融化充研磨立即加入预热提取缓冲液用手摇功混匀6C4i+L/Z*C5G)v3、65℃水域1min冷却至室温(N2@)U:S，{9M"e8f4、加入等体积(4mL)氯仿:异戊X17(2=L:1)混匀10000rpm，40C离10min(H6Po1y8p#?5、吸取清液加入等体积(4mL)仿:异戊醇(24:1)，混匀10000rpm，40C，离10min.{#k/z5r:x:v1x6、吸取清液加1/4体积IOMLiCL，混合4℃沉淀夜10000rpm离20min7xP4o6z1D![8}7、用枪吸干用500uLSSTE溶解沉淀转1.5mL离管.加等体积氯仿:异戊醇混匀10000rpm，40C离10min，H2b7C1d*[6r4c8、离吸取取清液加两倍体积水乙醉-70℃沉淀至少30min或200C沉淀2h"W*c'Y1P-t5K)^，`9、12000rpm，40C，离20min请用70%乙醇洗两吹干沉淀1x，S*X0V"y6F/l10、用40uLDEPC处理水溶解沉淀RNA品8f2C-S4R3O9R4Te&{11、除用于电泳紫外检测外其余RNA-70℃冰箱保存备用Q0o7V.]9x，{1i:__!U*X1m5G9A(W%U改良Krapp提取：1r)r#s3~|.q1v.w试验试剂：'C7Z1^)J&f&W(Kd1、RNA抽提掖：母液：4mol异硫氰酸胍20mmolEDTA20mmolMESpH7.0工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存4℃条件备用/a.I$E.RS%z2、RNA重悬液：2molLiCl10mmolNaAc调整终体积250mlpH5.2灭菌贮存4℃条件备用2u;J1S9V8a.j试验步骤：)O/o，L#q-D8v)U1、取新鲜植物材料0.5~1g冷冻干燥必要加入0.2g砂起研磨加入10mlRNA抽提掖充混匀7nQ:B"SN9B!J$u2、4℃条件8000rpm离10min层水相转移至干净离管加入等体积酚/氯仿抽提掖4℃条件8000rpm离10min1N:K+]3R"a7`3、清液转移至干净离管再用10ml氯仿洗清液1（加入10ml氯仿充混匀4℃条件8000rpm离10min.）$p+y，P/^-w/E'g"k0y:[4、清液转移至另干净离管加入1/10vol3molNaAc2vol冷水乙醇-80℃条件沉淀2:t&M8O1O!C-w5a5、4℃条件8500rpm离30min.弃清液沉淀重悬于RNA重悬液置于4℃条件19b7Z#K4v(y%l8Q0a8N)I%|6、4℃条件8500rpm离10min.弃清液沉淀溶于适体积DEOC处理水检测装置于-70℃条件保存
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桥科的风 
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