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测定步骤
调零用蒸馏水于605nm处调零。
样本测定(1)取900μL工作液加入1mL玻璃比色皿,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中孵育5min。
(2)取出比色皿,加入50μL酶液,混匀;立即记录605nm处初始吸光值A1,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确反应1min,记录605nm处1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
丙酮酸脱氢酶(PDH)试剂盒注意事项
1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置,以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、Z好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
PDH活性计算
1、组织中PDH活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/mgprot)=反应总体积(950μL)÷样本体积(50μL)÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数(21×10-3)×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL)
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH(U/g鲜重)=反应总体积(950μL)÷样本体积(50μL)÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数(21×10-3)×ΔA÷样本鲜重(g/mL)=905×ΔA÷样本鲜重(g/mL)
2、细菌或培养细胞中PDH活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/mgprot)=反应总体积(950μL)÷样本体积(50μL)÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数(21×10-3)×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL)
(2)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/104cell)=反应总体积(950μL)÷样本体积(50μL)÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数(21×10-3)×ΔA÷细菌或细胞密度(104cell/mL)=905×ΔA÷细菌或细胞密度(104cell/mL)
丙酮酸脱氢酶(PDH)试剂盒
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