仪器资讯

pUC-T TA快速连接试剂盒(含载体,连接酶)说明书

对比测试

pUC-TTA快速连接试剂盒(含载体,连接酶)说明书

pUC-TQuickLigationKit

pUC-TTA快速连接试剂盒(含载体,连接酶)

目录号:YJ2591

保存条件:-20℃保存。

组分说明

Cat.No.YJ2591

Size20次

pUC-T(50ng/μl)20μl

ConctrolInsert(50ng/μl)10μl

QuickT4DNALigase20μl

2×QuickLigationReactionBuffer120μl

本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及其他用途

产品简介

  pUC-TTA载体是一种GX克隆PCR产物的专用载体,它是由pUC18载体在EcoRV

酶切位点处切开,在两侧的3′端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR

产物的3′端添加一个A,它可以与pUC-T3′端的T互补连接,因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。

 试剂盒中配备GX率的T4DNALigase和为快速GXDNA连接优化的2×QuickLigation

ReactionBuffer。连接效率相当于用T4DNALigase进行常规连接1小时。带有插入片

段的重组子可根据α互补原理,进行蓝白斑筛选,判断载体中有无外源基因的插入。克

隆后可以用BcaBESTSequencingPrimers和M13通用引物对PCR产物进行测序。

注意事项

1.InsertDNA要求

1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A"尾。有些高保真DNA聚合酶,如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端,可使用加A试剂盒加上A尾后,再进行T载体克隆。

2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆,以免PCR产物中的非特异片

段或残存引物等杂质影响。推荐使用YJ2302/YJ0524/YJ0518快速琼脂糖凝胶

DNA回收试剂盒。

2.连接反应要求

1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点,

增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后,转化效率会明显降

低;如25℃快速连接反应过液夜,则转化效率会下降到75%。

2)2×QuickLigationReactionBuffer含有ATP,使用前置于冰上使其融化后充分混

匀,建议初次使用分装成小管冻存,避免其反复冻融影响DNA连接效率。

3)由于T4DNALigase中含有甘油,比较粘稠容易挂壁,建议使用之前短暂离心将

液体收集到管底,取样时枪头尽量不要深入液面太深,以免粘在枪头上造成损失。

4)如快速连接产物用于电转,因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率,建议

使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如YJ2301快速DNA产物纯化试剂盒)后再

进行电转。

3.感受态细胞要求

建议使用GX的热击转化感受态细胞,这样才可能得到比较理想的阳性克隆,如需

进行蓝白筛选,宿主细胞必须具有正确的基因型(F′编码的【lacZΔM15】)产生ω片

段,才能与载体DNA产生的LacZα多肽结合,表现出β-半乳糖苷酶活性(α互补)。

pUC-TTA载体以pUC18载体为基础构建而成,因此,适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司YJ0807T*P10感受态细胞、YJ0808DH5α感受态细胞。

4.阳性克隆筛选

阳性DNA片段成功插入至pUC-TVector中后,一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受

到破坏,重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白

色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时,基因的读码框有可能正好与LacZ的

读码框相吻合,克隆体也会显示蓝色菌落。

5.阳性对照

为了确认实验操作的正确性,以及实验试剂的有效性,我们建议使用本试剂盒中配

备的ControlInsert(750bp)进行阳性对照实验。

使用方法

1.按以下体系配制反应液:

成分反应体系对照体系

pUC-T1μl1μl

DNA插入片段*0.1-0.3pmol--

ControlInsertDNA--1μl

2×QuickLigationReactionBuffer5μl5μl

QuickT4DNALigase1μl1μl

RNase-FreeWater补足至10μl补足至10μl

*InsertDNA的使用量:在进行克隆时,VectorDNA和InsertDNA的摩尔比一般为:1:2-1:10,

可根据实验情况选择适当的VectorDNA和InsertDNA的摩尔数比。InsertDNA的使用量=nmol数×660×InsertDNAbp数。本载体1ml(50ng)的摩尔数约为0.03pmol。

2.轻轻混合,短暂离心。25℃反应5分钟。

注意:反应时间不要超过15分钟,否则会降低连接效率。

3.反应结束后,将DNA连接产物存放于0-4℃,而后进行转化实验;也可将DNA连接

产物置于-20℃保存。

注意:勿进行加热失活反应。

4.将连接产物加入50μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化),冰浴30分钟。

注意:用化学法转化时,连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。

5.42℃热击45秒钟,迅速将离心管转移到冰浴中,冰上静置2-3分钟。

6.加入450μl无菌SOC或LB培养基,混匀后置于37℃摇床,150rpm振荡培养45分钟,

使菌体复苏。

7.根据实验要求,取适量已转化的感受态细胞,加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体

培养基上,用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于37℃,直至液体被吸收后,

倒置培养,37℃培养12-16小时。

8.计算白、蓝色菌落,挑选白色菌落,使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。


仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。

相关热词:

等离子清洗机,反应釜,旋转蒸发仪,高精度温湿度计,露点仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,高压灭菌器,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜



2004-08-31
您可能感兴趣的产品评测