Ultimate色谱柱说明书

深度解析

色谱柱的正确使用
色谱柱是昂贵的色谱耗材，正确的使用和维护对保证色谱柱的正常使用和延长寿命至关重要。
1.色谱柱使用前注意事项：
1)色谱柱内的存储液：
月旭公司色谱柱的存储液，如没有特殊说明均为质检报告中所述流动相，检测前，请用相互溶的试剂将其替换。
2)新色谱柱的平衡：
新反相色谱柱：用纯甲醇或者纯乙腈冲洗色谱柱30个柱体积（1个柱体积=空柱管体积×0.7），再更换成能与检测流动相互溶的流动相冲洗30个柱体积，Z后用流动相稳定系统至基线平稳；

新正相色谱柱：反相使用异丙醇低流速（0.2ml/min）冲洗30个柱体积；正相使用采用正己烷分析流速冲洗30个柱体积，再更换成能与检测流动相互溶的溶剂冲洗30个柱体积，Z后用流动相冲洗稳定系统至基线平稳待检测。

2.色谱柱的使用方向：
月旭公司生产的GX液相色谱柱标签上的箭头方向为流动相流向，使用过程时也按此方向连接出入口，避免双向混用，导致两端填料同时污染，不利于色谱柱的再生和维护。
3.流动相和样品保持洁净：
由于悬浮在样品或流动相中的细小颗粒会堵塞色谱柱两端的筛板，各种试剂尽量使用色谱纯级的，用量少的试剂纯度至少是分析纯，水Z好是超纯水和全玻璃器皿双蒸水，使用前建议用0.45μm的滤膜过滤；

样品溶液使用针头式过滤器；
样品中的杂质是造成色谱柱污染、柱效下降的Z主要原因之一，复杂样品可选样品预处理柱（SPE柱）进行前处理，如果不方便处理，建议使用与分析柱相匹配的保护柱。样品溶剂与流动相要相匹配，不能出现样品溶剂与流动相不互溶，极性相差太大等情况，否则会造成色谱峰形变差、鬼峰等现象，使用流动相溶解样品能有效的避免上述情况发生。
4.色谱柱允许使用的pH范围：
每款色谱柱都有自己特定允许使用的pH范围，请仔细对照您的色谱柱的使用pH范围（表一），在pH范围以外使用，会使硅胶基质溶解或键合相水解，对色谱柱造成不可恢复的损伤，如果在临界pH处使用，分析结束后立即用适合于色谱柱保存并与当前使用的流动相互溶的淋洗液置换掉。

色谱柱的保存
短时间保存：
间隔不超过四天，色谱柱按平时维护程序冲洗至基线平稳，反相色谱柱保存在不含有缓冲盐、离子对试剂的有机相/水溶液中，有机相不低于20%；正相色谱柱正相使用保存在纯正己烷中，反相使用保存在纯有机溶剂中，并将随柱的塑料堵头旋紧密封。
长期保存：
反相色谱柱保存在80%甲醇或80%乙腈水溶液中；正相色谱柱正相使用保存在纯正己烷中，反相使用时需将柱内存储液用异丙醇置换，Z后用正己烷保存，Z好将色谱柱从仪器上取下，并将随柱的塑料堵头旋紧密封。

色谱柱的日常维护（推荐反向冲洗）：
反相使用（包括反相色谱柱和正相色谱柱反相使用）清洗方法：
1)未使用缓冲盐，分析完成后用80%甲醇或80%乙腈反向冲洗色谱柱10-20个柱体积，保存柱子；
2)使用缓冲盐，用过渡流动相或者低比例有机相反向冲洗柱子10-20个柱体积去除缓冲盐，用80%甲醇或80%乙腈反向冲洗色谱柱10-20个柱体积，保存柱子；
3)使用离子对试剂，用过渡流动相或者低比例有机相反向冲洗柱子10-20个柱体积去除缓冲盐，再用50%甲醇反向冲洗柱子10个柱体积，Z后用80%甲醇反向冲洗色谱柱10-20个柱体积，保存柱子。
正相使用（正相色谱柱正相使用）清洗方法：
分析结束后，用异丙醇反向冲洗10~20个柱体积再换正己烷反向冲洗柱子10-20个柱体积，保存柱子。

色谱柱的异常维护（按照日常维护冲洗方向）
1.柱压升高
柱压升高是每个色谱工作者都很头疼的问题，长时间使用造成柱压的缓慢升高通常是正常现象；短时间甚至是突然的柱压升高通常是异常升高，排除仪器的故障，确定是色谱柱自身原因，一般有以下几点：

1)柱头的过滤筛板污染（固体颗粒物堵塞、强保留物质累积）：

解决方法：
a.在柱前端加上在线过滤器或保护柱，用甲醇/水=20/801.0ml/min反向冲洗色谱柱180min；

b.在柱前端加上在线过滤器或保护柱，反向使用；
c.可将柱头打开，将色谱柱头中过滤筛板取出，在稀硝酸溶液内超声清洗20min，纯水超声清洗20min，Z后用甲醇超声清洗20min，重新装入色谱柱。

2)柱头填料污染（固体颗粒物堵塞、强保留物质累积）：
解决方法：
a.用可以溶解污染物的溶剂较长时间（180min）反向冲洗色谱柱；
b.可将柱头打开，小心取出被污染的填料，用相同的填料重新装入修复。
3)pH使用不当造成的损伤：
解决方法：
pH使用不当造成固定相的缺失或塌陷，很难使色谱柱恢复，只能更换色谱柱。

2.推荐使用保护柱和在线过滤器：
样品和流动相中不能完全过滤掉及泵磨损、密封圈和管路老化产生的固体颗粒物，进入到色谱柱中就会堵塞筛板，导致柱压升高，柱效下降，保护柱和在线过滤器上都有筛板，孔径与分析柱的孔径相同，能阻止颗粒物到达色谱柱，在分析故障中，柱压升高占很大比例，因此建议您在色谱柱前端加上在线过滤器或者保护柱。
3.缓冲盐的正确使用：
缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，其使用不当会析出，加快泵柱塞杆和密封圈，流通阀的磨损，堵塞色谱柱头筛板，填料基质上的微孔和颗粒间的间隙，使填料板结柱压升高，阻碍基质上键合相的碳链自由舒展，使色谱柱保留能力下降，柱效降低，缩短其使用寿命，缓冲盐析出后很难去除，因此正确的使用缓冲盐对延长色谱柱的使用寿命非常重要，具体方法如下：“使用前过渡!使用后冲洗!”

分析前用过渡流动相冲洗柱体积5~10个柱体积，分析完成后按照色谱柱日常维护2)项处理；
过渡流动相：有机相和水相的比例和分析流动相中两相比例一致，或者水相比例高于分析流动相，不含缓冲盐。
缓冲盐析出处理方案：
1)方案1：用甲醇/水＝10/90以分析速度流速35℃条件下反向冲洗色谱柱40个柱体积；
2)方案2：用甲醇/水＝10/90以0.2ml/min流速反向冲洗色谱柱夜。

4.避免强保留物质在色谱柱保留：
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，是一个缓慢的过程，一段时间后会对样品成分产生额外的保留行为，引起峰变宽，拖尾，使柱效下降，保留时间变化，到一定程度时会导致柱压升高，对许多样品特别是复杂样品很难判断其是否含有强保留物质，因此要预防这一切的方式，坚持每天分析完成后用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上。但若长时间没有反向冲洗的柱子，请谨慎反冲。
注意：不要轻易打开柱头，因为柱头一旦打开，很难恢复到新柱的水平，因为柱头打开而造成的检测后果，客户自行负责。

各种键合相色谱柱的再生(请慎用)
色谱柱作为液相色谱中昂贵的色谱耗材，会随着使用时间和进样次数的增加，会出现异常的色谱现象，如果一根色谱柱的柱效太低或者柱压太高，通常认为该色谱柱使用寿命已到，为了延长色谱柱的使用寿命，除了完全按照每一款色谱柱的性能使用以外，适当的色谱柱再生是很有效的途径：

1.氰基(CN)色谱柱的维护和再生：
CN柱属于中等极性的固定相，作反相色谱时操作和维护和C18柱完全相同，增加水相比例，可以促进样品的洗脱，但是CN属于短链的键合相，水相比例太高易使CN键水解，尤其在色谱柱pH耐受范围以外，极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用，需要按以下程序用15个柱体积溶液冲洗，如下：

过渡流动相95%乙腈并保持95%乙腈继续冲洗，以低流0.2mL/min夜冲洗；
在pH耐受范围条件使用时，也比较伤柱子，要注意冲洗，可以参照上述方法，时间可适当减少。CN柱用于正相时，当柱子使用一定时间后，柱效下降，可清洗一下恢复柱性能，再生时用10个柱体积的下列溶液冲洗：氯仿异丙醇二氯甲烷再走流动相即可；

CN柱Z理想的pH范围在pH2.0-8.0。

2.反相柱的再生：
反相色谱柱是使用Z普遍的色谱柱之一，除按照以上内容使用以外，必要的再生清洗可以有效的延长色谱柱的使用寿命，用下列每种溶剂20~30个柱体积冲洗：
100％甲醇100％乙腈100％异丙醇100％二氯甲烷或100％正己烷100％异丙醇100％甲醇

3.正相色谱柱的再生：

正相柱的键合官能团氨丙基、二羟基丙基等要比C18,C8柱的键合官能团易水解，所以其使用寿命稍短，特别是使用反相条件时，要严格控制pH值范围，pH值越低流动相中水的比例越高越易发生水解。

填料被样品中杂质累积污染，色谱柱表现行为柱压柱效降低等，依次用下列程序冲洗柱子：
甲醇乙腈异丙醇氯仿正己烷氯仿异丙醇甲醇（各以0.5ml/min的流速，20个柱体积），再换流动相。

用氨基柱检测酸性物质可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，一定程度上改变对某类的分析物保留性质或表现为柱效下降，再生建议是：用5-10个的柱体积的含0.5-1.0％NH3的50-50乙腈-水溶液冲洗（冲洗后用不含碱的流动相洗去多余的氨），分析酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1％。

如何改善和提高正相色谱的重现性？
在正相色谱分离模式中，水是一种溶剂强度非常高的溶剂，即便流动相中有少量的存在就能对保留时间产生强烈的影响，特别是在硅胶或氧化铝为固定相而使用的流动相非极性或疏水性很强的情况下尤
其是这样。因为烷烃类溶剂天然含水量极低，基于无水烷烃的流动相，需要很长时间才能和环境中水分达成平衡。所以，正相色谱柱使用几天后就观察到保留时间有漂移的现象是司空见惯的。可能正是存在这个令人头疼的问题，成为了当今正相色谱没有反相色谱那么普及常用的主要原因。有一个非常有效的改善正相色谱保留时间重现性的方法：使用和水“半饱和”的正相流动相。
“半饱和”流动相配置方法：将无水的非极性流动相分成两半；其中一半中加入一定量水，并混匀搅拌约一小时，静止分层后，将多余的水相全部除去；将无水的一半流动相和已与水饱和过的另一半流
动相两部分重新混合在一起，就配成了“半饱和”流动相。
正相色谱柱除水：
正相柱一般用的流动相是正己烷等非极性溶剂,水是强极性溶剂,正相色谱中用的量很少，水含量稍微一点的小变化，就会对出峰时间有很大的影响，所以正相色谱对水分含量极敏感。正相填料，硅胶、
氨基、CN基等，本身并无特殊，也不是碰到水就会损坏的。随着时间的推移，正相填料会因为吸附了过多的水分而改性，导致保留能力改变，故需要按使用下列溶剂对固定相进行脱水：
含2.5%二甲氧基丙烷（dimethoxypropane）和2.5%冰醋酸的正己烷冲洗30个柱体积。

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2004-08-20