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近红外荧光探针(IRB-NHS)检测试剂盒使用常见问题解答

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近红外荧光探针(IRB-NHS)检测试剂盒使用常见问题解答 点击次数:452 发布时间:2016/11/3

近红外荧光探针(IRB-NHS)检测试剂盒使用常见问题解答

1.投量一般是按摩尔数比来算的,大概是需要接入氨基的个数的2倍投量。用这个方法换算的话,因为不知道 IRB-NHS 里面含有几个活性酯,所以具体的量无法确定。
答复:每个IRB-NHS中只有一个活性酯,但由于IRB-NHS本身水解作用,其投料比往往控制在伯氨基的1.5-2.0倍左右。

2.标记抗体时,抗体与染料的投料比是多少?
答复:是1:3(摩尔比),大概每个抗体上可以标记1个左右荧光基团。

3.想用这个染料修饰的材料的分子结构式中含有氨基(伯胺)和羧基,有两个问题:
1)羧基会不会参与反应?如果会的话我需要如何处理?
答复:羧基不会参加反应,IRB-NHS只与待标记材料中的伯氨基反应生成稳定的酰胺键。
2)这种染料在与伯胺反应后,水溶性如何,还会有何种水溶性基团。
答复:荧光基团本身含两个磺酸基,其水溶性很好,不会现在改变所标记材料的水溶性。

4.该染料的分子结构信息,可否提供?
答复:母核是花菁类染料,可以提供其基本结构。

5.关于“配制的DMF稀释液需立即使用。存放导致活性迅速丧失”这个说明,染料标记上靶分子以后,荧光可以持续多久?
答复:活性丧失主要是指活性NHS酯基基团破坏,无法与待标记材料商氨基键合,并非指荧光信号本身消失。连接上目标材料后,低温避光保存,固体状态荧光可以维持数月,液体状态数周。

6.有一个实验方案如下:标记的是一个多肽,共61个氨基酸,大小为6.6KD。
1)多肽溶于无菌PBS中,终浓度为10 mg/ml。
2)将0.2mg IRB-NHS 粉末配置成  DMSO 溶液( 0.01 mg/uL)。
3)将配置好的20ul染料立即逐滴分别滴加至200ul 10mg/ml 多肽溶液中,至于摇床,室温反应2 h。
4)反应结束后,反应液加入超滤管中进行超滤( 4000 rpm,30×3min )取超滤管上层溶液。
5)尾静脉注射SCID小鼠,100ul IRB-NHS -V5/mice
   请问这个方案合理吗?

答复:该方案基本合理。反应环境pH可以控制在7.4-8.3之间。IRB-NHS使用量(摩尔数)应为根据每条多肽期望的荧光基团个数的两倍量。另要确保多肽上有足够的伯胺基可以与NHS活性酯反应。另外,尽量避免多肽上功能区域的胺基与荧光基团反应从而影响多肽活性。反应结束后,建议纯化后观察材料颜色。成功标记后的材料应该呈深绿色。

7.抗肿瘤抗体,190KD,想做近红外靶向成像实验,抗体和染料的比例是多少?在尾静脉100ul情况下打入的抗体应该控制到多少摩尔,多少质量会有比较好的成像效果?感觉Z重要的环节就是比例和用量,不然小分子多的话靶向性真的体现不好,其他代谢部位都有扩散。  
答复:一般每个抗体上标记2-5个近红外荧光分子就能够很好进行成像。抗体注射剂量与诊断和ZL目标有关,有很多文献可以查到!标记到抗体上的荧光基团由于数量很少,不会对抗体靶向性产生影响!

8.激发波长对实验结果影响多大?有的仪器没有789nm的波长?
答复:Z佳条件是在探针Zda吸收处激发,但在730-780 nm处激发都有较强信号! 

9.感觉这个固体粉末是不时间稍久就会沾到管壁上,上次做的时候,用的是实验室师兄以前买的,但都沾到了管壁上,不能够实际称量,我就用DMSO溶解了,但感觉比例就加的不对了,染料可能加多了,胃肠处的荧光强度太强,都曝红曝白了
答复:活体注射是要摸索剂量的。该探针由于含有NHS基团,不宜长期存放,建议购买后3个月内使用!不能配成溶液后存放!

10.在染料和抗体偶联完后,三次超滤后仍见超滤下来的液体是绿色,是否为染料加入过多?是否要超滤到无色为止?
答复:Z好超滤液中不要有明显绿色!但也有可能是滤膜不好导致抗体滤出导致颜色。

11.如果多肽分子量太小,1.5KD 用什么纯化方法比较好?可以用HPLC纯化吗?
答复:一般利用层析柱分析。根据分子量差异进行分离。探针分子量为800,所以很容易进行分离。

12.多肽是1400,不好分啊?cy5.5可以用HPLC不知道你们的这个可以不?HPLC对偶联后的多肽和IR影响大吗?
答复:1400和标记荧光基团后的2200还是可以用层析住分的。分子量还是差别较大的。也可以用HPLC分。不过更耗时一些。

13.1.4KD的多肽和IR783耦连后,如何把多余的IR783去除掉?具体一点的方法。
答复:利用标记前后分子量不同可以通过柱层析分离。

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2004-07-12
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