流式细胞仪技术(FCM)

　　流式细胞术(FCM)简述

　　流式细胞术 (Flow Cytometry)是70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观多参数相关检测分析的新技术。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。

　　FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器。

　　FCM的基本原理

　　1、流式细胞仪系统流程：

　　标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统→结果打印

　　2、基本原理：

　　待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后进入充满鞘液的流动室，鞘液压力与样品流压力是不同的，当二者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性的标上荧光染料，那麽这些染料将在细胞通过激光检测区时受激光发出特定波长的荧光,通过一定波长选择通透性的滤色片,我们可将不同波长的散射光、荧光信号区分开来，并送到不同的光电倍增管中，经过一系列的信号转换、放大，数字化处理，我们就可以在计算机直观的统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FC同时测定一个细胞上的多种不同特征;如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。

　　3、意义：

　　FCM与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验与研究的重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达位点的细胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对免疫功能障碍、造血系统疾病及恶性肿瘤的研究、诊断、ZL和预后评估都能起到重要作用

　　应用分类

　　1、免疫表型分析

　　1993年在波士顿召开的人类白细胞分化抗原会议(leukocyte differentiation antigen,HLDA)

　　将CD抗原(cluster of differentiation)分为T细胞、B细胞、髓细胞、血小板、内皮细胞、自然杀伤细胞、活化抗原、黏附因子、细胞因子和细胞因子受体等九个组，确立了48种新抗原。

　　1996年11月在神户召开的第六届HLDA会议上，又有30多种新抗原被确认，CD编号已达166个，CD抗原有197种。2000年7月，第七届人类白细胞分化抗原会议的召开，CD抗原已达247种。CD系列在免疫学中常被用于:(1)CD抗原的基因克隆，新CD抗原及新配体的发现;(2)CD抗原功能与结构的关系;(3)细胞激活途径和膜信号的传递;(4)细胞分化过程中的调控;(5)细胞亚群的功能。

　　免疫表型分析的应用

　　1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态(淋巴细胞是机体免疫系统功能*重要的大细胞群，在免疫应答过程 中，末梢血淋巴细胞发育分化成为功能不同的亚群。当亚群的数量和功能

　　发生异常时，就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开来，并计算出它们相互间的比例，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，并指导ZL)。

　　2.白血病/淋巴瘤免疫分型 ;

　　3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系;

　　4.干祖细胞的定量及成分分析;

　　5.粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋白的分析等等;

　　6.疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据;

　　7.免疫调节：细胞因子/受体的相互作用、共刺激分子受体/配体的相互作用;

　　8.发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递障碍有关;

　　9.药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物ZL的时机选择、以及效果的监测 ;

　　10.免疫状态评价： 移植、放化疗等。

　　2、DNA含量及细胞周期分析

　　细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白(CYCLIN)、Ki67、核增殖抗原(PCNA)等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.应用于：肿瘤的早期诊断、肿瘤的良恶性判断、观察细胞的增殖状态及周期分布和LX监测。

　　3、定量分析

　　1.检测细胞特异性标记物：FCM不但可以定性分析标记物，而且可以进行定量。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原定簇的个数;

　　2.CD4**计数;

　　3.CD34**计数;

　　4.可溶性物质(如细胞因子)的高通量定量检测 。

　　4、细胞功能分析

　　1.吞噬功能试验;

　　2.氧爆发试验;

　　3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液免疫的II型细胞;

　　4.药物泵的功能检测 ;

　　5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测;

　　6.血小板的粘附,聚集功能检测。

　　5、细胞凋亡研究

　　1.鉴别凋亡与坏死;

　　2.测定凋亡率;

　　3.研究凋亡触发机制。

　　6、其它

　　1.微生物快速鉴定及药敏;

　　2.分子流式细胞术，利用寡核苷酸为探针，检测端粒酶的长度;

　　3.运用抗体进行血小板抗原基因型分型;

　　4.利用GFP或YFP为探针检测基因转染;

　　5.死、活细胞鉴定等等。