纯水服务于流式细胞技术进行植物生殖细胞学研究

对比测试

流式细胞术的发展
流式细胞术Z初是开发应用于医学领域的，但是随后逐渐演变成了细胞计数、分类以及生物标记探测等不同领域内的有利工具[7]。尽管相关的diyi篇采用流式细胞术进行植物细胞核分析的文章发表于1973年[8]，但是采用流式细胞术所开展的植物DNA分析在上世纪80年代末才获得了突飞猛进的发展，从此所有研究人员都开始坚定地在植物研究领域使用该项技术。基本上，植物学家都是使用流式细胞术来测定植物细胞核中的DNA含量。有关流式细胞术详细的原理及应用的描述，请参阅参考文献9。

图2a概括表示了流式细胞仪如何通过电子检测设备用一束水动力集中的液体流对经染色的或靶向的粒子（尺寸介于0.2µm-150µm[7]）进行悬浮排列。在植物研究中，先用荧光标记物（比如：DAPI[4’,6-二脒基-2-苯基吲哚]或碘化丙啶）对细胞核（比如：粒子）进行染色。然后，每一个悬浮的细胞核暴露于光束（通常为激光或UV灯光）之中，于是光的路径被分散并由检测器感知，用于分析每一个单独粒子的荧光强度，为核酸中DNA含量的测定提供信息。成千上万个完整细胞核的合并数据可为单独组织的DNA含量提供信息（参见图1中的波峰）。由于每一秒钟几乎会同时进行分析多达数千个粒子的物理和/或化学特征，因此用于样品分离和样品检测的溶液的质量和纯度非常关键。

如果使用的是低品质或不合适的水供应系统，则出现的不属于样品的污染物颗粒会发生荧光反应并产生“噪声”，这会干扰检测结果并导致Z终错误的评估。因此，实验时必须要使用高品质的超纯水。

超纯水系统生产的超纯水达到ASTMI级品质
能够生产出达到ASTMI级品质超纯水的超纯水系统由赛多利斯（哥廷根，德国）提供。使用arium®proVF水系统生产的超纯水（ArUPH2O）进行流式细胞分析，为了评估超纯水对分析结果的质量所产生的影响，作者检查了兼性孤雌生殖的被子植物用于生产种子的繁殖途径。这是通过比较分别采用ArUPH2O和标准鞘液溶液（0.04%叠氮化钠，0,01%去污剂）对样品进行检测所获得的结果而实现的（PartecGmbH）。

arium®proVF系统（图3）从经过预处理的饮用水中通过去除所有污染微粒而生产出超纯水。超纯水的生产需要持续循环和一个恒定的水流速率，这可以通过一个带压力控制功能的泵系统来实现。在进水端口和下游端口，或者产水端口进行电导率的测定。

本文所描述的测SYarium®proVF水系统（老一代与当前的新一代arium®proVF水系统有着完全相同的技术设计，如图3所示）通过两支不同的滤芯来工作。这两支滤芯装填有特殊的活性炭吸附剂和混床离子交换树脂，用以生产总有机活性炭（TOC）含量极低的超纯水。此外，系统还有一个集成的UV灯，在波长为185nm和254nm时分别具有氧化有机物和杀菌效果。

除此之外，arium®proVF超纯水系统有一个内置的作为切向流过滤器使用的超滤模块。该过滤器中整合的超滤膜可截留胶体、微生物、内毒素、RNA以及DNA等。出水端口安装有一个0.2µm的终端过滤器，用以去除超纯水生产后分配过程中的微粒和细菌。该设备生产纯水的工艺流程请参阅图4。

材料与方法
种子样品来源于六倍体毛茛属植物，在自由授粉的条件下进行挑选收集。种子个体在塑料有盖培养皿内用300µl的提取缓冲液（CyStainUVPreciseP,PartecGmbH）进行碾碎，然后在室温下孵育10分钟，再将细胞核过滤（30µl浆状物，CellTric®,PartecGmbH）至一个5-mL的塑料管中。而后，加入1.2mL染色缓冲液（CyStainUVPreciseP），60秒后，样品进入流式细胞仪（CyFlowSpace，PartecGmbH；参见图2b）的蓝色荧光通道进行分析。更多内容»

结果
总共有61个单独种子重建了繁殖途径。根据建议的标准程序，30个种子使用鞘液悬浮，31个种子使用ArUPH2O（电导率：0.055µs/cm或18.2MΩ×cm电阻补偿至25℃）悬浮。平均每个样品测试了2329个细胞核，占总计数粒子的73%，而其它27%表现为细胞周期G2阶段的细胞核或者背景信号。针对所有被分析的种子，全部要根据每个峰所富集的平均总数来计算胚胎和胚乳的平均峰位置。更多内容»

讨论
总之，所获得的测试结果中具有极小的差异，这证实了arium系统是适用于植物材料相对倍性分析的快速又经济的选择。高品质的arium超纯水水被证明用于实现流失细胞种子筛选技术上的可重现结果是非常有效的。尽管如此，由于抗生素和去污剂之类的添加剂具有可阻止生物膜的形成，以及增加容器、管道、阀门以及流动腔内表面的湿度等作用，对流失细胞系统的可靠操作会造成长期或短期的正面影响，因此供应商一般会建议在自制的鞘液中添加此类物质。

简而言之，ArUPH2O可即时用于植物细胞的流式细胞技术。由于流失细胞技术在其它应用中越来越重要，比如肿瘤细胞的检测，细胞的定量测定与形态分化，细胞周期分析，DNA-RNA含量估算，以及凋亡检测等等，ArUPH2O的全面适用性为arium超纯水在一系列使用流式细胞术的新兴技术中的应用创造了新机会。

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参考文献
1.Johri,B.M.EmbryologyofAngiosperms.Springer-Verlag:Berlin,Ger¬many,1984.
2.Nogler,G.A.GametophyticApomixis.In:EmbryologyofAngiosperms;Johri,B.M.,Ed.Springer-Verlag:Berlin,Germany;pp475–518.
3.Battaglia,E.Themaleandfemalegametophytesofangiosperms—aninterpretation.Phytomorphology1951,1,87–116.
4.Asker,S.E.;Jer领,L.ApomixisinPlants.CRCPress:BocaRaton,FL,1992.
5.Hojsgaard,D.H.;Martínez,E.J.etal.Competitionbetweenmeioticandapomicticpathwaysduringovuleandseeddevelopmentresultsinclonality.NewPhytologist2013,197,336–47(andsupportinginforma¬tionintheonlineversionofthisarticle).
6.Dittrich,W.;Göhde,W.PatentDE1815352,Flow-throughChamberforPhotometerstoMeasureandCountParticlesinaDispersionMedium;1968.
7. en.wikipedia.org/wiki/Flow_cytometry.
8.Heller,F.O.DNS-BestimmunganKeimwurzelnvonViciafabaL.mitHilfederImpulscytophotometrie.(DNAestimationonradiclesofViciafabaL.usingpulsecytophotometry;translationoftheoriginalGermantitlebyDr.Herbig.)BerichtederDeutschenBotanischenGesellschaft1973,86,437–41.
9.Dolezel,J.FlowcytometricanalysisofnuclearDNAcontentinhigherplants.Phytochem.Anal.1991,2,143–54.
10.Matzk,F.;Meister,A.etal.Anefficientscreenforthereproductivepathwaysusingmatureseedsofmonocotsanddicots.PlantJ.2000,21,97–108.
11.Paun,O.;Hörandl,E.Evolutionofhypervariablemicrosatellitesinapo¬micticpolyploidlineagesofRanunculuscarpaticola:directionalbiasatdinucleotideloci.Genetics2006,174,387–98.

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