食品微生物快速检测方法

传统的微生物培养法耗时太多，不利于工厂生产的快速调整，因此，需要建立现代的微生物快速检测方法。快速测定方法建立的基础是：利 用现代技术测定微生物的代谢产物或微生物的繁 殖速度，以确定微生物的数量。现将国外较成熟， 常刚的典型快速测定方法介绍如下：
    微生物的快速检测方法按检出时间可分为三类：
    **类方法是在比相应的传统方法短的时间 内得出结果。此类方法的典型例广是：膜过滤一微 菌落一荧光法。具体方法是将一定量的样品(或样 品稀释液)经膜过滤(过滤膜φ巾≤0．45μm)，再过滤 膜放在培养基上或放在浸行液体培养基的厚纸板 上在适宜温度条件下培养一段时间，然后将膜放 在浸过0．1％ANS(8一苯胺基萘磺酸镁)溶液的纸 片上作用10分钟，将膜揭下，在80℃条件下干燥 5—10分钟，*后在100倍的荧光显微镜(入=340~ 380nm)下计数蓝绿色菌落的数目。
    对于不同样品，膜过滤一微菌落一荧光法使 用的培养基和培养时间不同。检验凝乳中酵母菌 时，可采用含琼脂的固体培养基，也可放在2ml双 料液体培养基浸润的纸片上培养15—24小时。检 验食品中需氧性细菌数时，可用琼脂计数平板，也 可用营养肉汤或酪蛋白胨一豆粉蛋白胨液体培养 基，培养8小时。食品中酵母和霉菌的选择性检测 可使用添加100ppm氯霉素的麦芽汁提取物琼脂培 养基，或添加100ppm氯霉素的双料麦芽汁提取物 液体培养基。糖果中耐渗透酵母的检测可采用50% 葡萄糖液体培养基，培养时间为48小时(菌数>10个／克)—72小时(菌数≤10个／克)。
    第二类快速检测方法一般在6—12小时内得 出检验结果。典型的方法有放射性示踪法和阻抗 测定法。
    放射性示踪法是以放射性标记物作碳源，测 定经微生物发酵产生的有放射性标记的CO2量，从 而确定样品中含菌量。测定菌数小于1000个／毫 升的样品，大约需要7小时。
    阻抗测定法可根据食品的微生物污染程度在 一天内完成检测。这种方法依据的原理是：微生 物在培养基中不断缯殖，其代谢产物的增加会导 致液体培养基中电阻的变化，使介质的导电性增 强，即电阻减小。只有当微生物数目达到106~107 个／毫升时，这种电阻的变化才能被记录到。样品 *初的含菌量越高，电阻的可检测变化就越容易 被确定。电阻或导电性变化达到可检测的时刻，称 为检出时间。
    阻抗测定法可以用于各种食品的总菌数测 定。鲜肉表面菌数为107个／cm2时。检出时间为2小 时；作猫狗粮的动植物性原料中需氧菌检测，约需 要6小时(106个／克)—10小时(105个／克)；色拉中 乳酸菌的检测需要15—20小时(104个／克)；浓缩 果菜汁小酵母菌检测约需要9—15小时(104个／毫 升)；蔬菜汁小芽孢杆菌营养体的检测约需要10小 时(104个/毫升)~18小时(102个／毫升)。
    应注意，对代谢不活跃的微牛物不能用阻抗 代谢法测定。除了检测需氧菌菌数，这一类方法还 可以进一步用于食品中非致病菌和致病菌的选择 性检测及其它领域。例如，抗生素—抗药性检测、 消毒剂检测、维生素检测、药物和化妆品中微生物 检测及生物胺的检测等方面。
    第三类食品中微生物快速检测的方法一般可 以在1~3小时内得出结果，其中较为典型的方法 有：Limulus—测试法，ATP测定法，直接表面荧光 过滤技术以及氧气消耗测定法等。
    Limuhs—测试法用于革兰氏阴性菌脂多糖 的测定。这种方法可以在30分钟—1小时内定量测 定食品中存在的死去的和活着的革兰氏阴性菌的 细胞壁组成部分。这种测定法是使用剑尾蟹 (Limulus polyphemus)的变形细胞的溶菌产物来进 行的。剑尾蟹的血液被革兰氏阴性菌浸染时会发 生凝结，这是由于细菌的细胞壁组分(脂多糖)和变 形细胞之间出现丁胶凝作用，变形细胞是一种剑 尾蟹血液中特有的血细胞，它含有酶原和凝集酶， 当存在脂多糖时，酶原被激活，进一步与凝集酶反 应发生胶凝作用。内毒素的鉴别就是根据胶凝作 刚进行的，因为内毒素与革兰氏阴性菌含量呈线性关系，所以可以根据革兰氏 阴性菌的污染程度确定内毒素的含量。
    这个方法可用于食品中内毒素的快速检测，特别是新鲜易腐败的如牛奶、肉、鱼和蛋等食品，因为这些食品上的细菌多为革兰氏阴性菌。此方法还用于鉴定加工食品原料中革兰氏阴性菌（包括死菌在内）的含量，蛋白制品的卫生细菌学质量检测、肉类食品的细菌学质量检测，以及医学范围内的注射液质量检测等多个方面。
     ATP测定法是利用生物发光法，应用荧光素—荧光素酶制剂进行的，在活细胞中ATP含量近乎是恒定的，利用特殊的酶试剂水解掉细菌膜，使ATP释放，ATP与荧光素—荧光素酶制剂反应变成AMP和光，产生的光强度与ATP成正比，通过测定光强度可确定细菌浓度。这咱方法可用于鲜肉、鲜鱼、牛奶、啤酒、矿泉水以及无菌药品的检测等多种领域。
     ATP+荧光素+荧光素酶（Mg2+）→荧光素→荧光素酶→AmP+焦磷酸
     荧光素→荧光素酶→AMP（O）→氧化荧光素+荧光素酶+AMP+CO2+光
     直接表面荧光过滤技术，是将含菌产品制成过滤的食品均质液，经核孔一多聚碳化物膜过滤后，用吖啶橙染色效果不好，添加荧光增白剂天来宝（Tinopal），可以使模糊菌像变为可见，染色的菌发出的荧光从绿色、橙黄色到红色。检测时间为20-30分钟。
     总菌数/毫升=滤膜面积×计数菌落的算术平均值/视野面积×样品值
     氧气消耗测定法建立在密闭系统中连续极谱氧气测量的基础上，在密闭系统中微生物的低谢值越高，液体样品一培养基中氧气消耗越快。在25℃条件下的氧气测定室中，检测含菌数在104~107/ml的牛奶食品，大约1小时可以得出结果。