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ELISA试剂盒测定步骤：固相包被→加待测样品→温育→洗涤+加酶标物→温育→洗涤→加底物→温育一加终止液→比色→判定结果。
ELISA试剂盒操作较繁杂,在操作中应注意以下5个方面。
1.随着病情的进展或由其他因素影响，某些抗体在机体内的含量发生大幅波动，因此有必要对标本进行预处理。间接法测定中，标本适当稀释还可降低非特异性反应。
2.加样一般使用加液器，在ELISA试剂盒中一般有4次加样：加标本、加酶结合物、加底物和加终止液。加标本时必须每份标本使用一支移液器吸嘴，以免交叉污染。加酶结合物、底物和终止液时则不需更换吸嘴。
3.在成批手工检测中，还应注意操作时差的影响。加样及混匀时间的差异，使抗原抗体反应和酶促反应时间不一致，对竞争法及定量检测影响很大，不注意可能会导致错误结果或定量不准。
4.洗涤是ELISA试剂盒操作过程中决定实验成败的一个关键步骤。目的是除去未结合的免疫反应物，终止抗原抗体反应，除去标本中与反应无关的成分、游离的酶标物以及反应过程中吸附于固相载体上的非特异性物质。可用洗板机洗板或手工洗板，前者洗涤质量较好，各反应孔洗涤效果均一，批内、批间差异小，手工洗板应注意控制各孔洗涤效果，差异不宜太大。
5.准确判定结果须使用ELISA试剂盒测读仪，比色法判读可选择单波长或双波长，根据反应液颜色的不同选用不同波长的滤光片，以空白孔校零测定反应孔的吸光度值。酶标仪具有良好的重复性。
