考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋白含量

考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋白含量

1、实验目的：掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋白含量的原理和方法。

2、实验内容

实验原理：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的Zda吸收峰的位置（λmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别色精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测得的吸光度A595nm,与蛋白质浓度成正比。

试剂与材料：

1.标准蛋白质溶液

称取牛血清白蛋白（BSA）10mg，溶于100ml水，配置成100μg/ml的标准蛋白质溶液。

2.考马斯亮蓝G-250染料试剂

100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95％的乙醇后，再加入120ml85％的磷酸，用水稀释至1L。

3.材料：豆芽

操作步骤：

1标准曲线的绘制

取试管6支按下表操作，摇匀，2～5min后比色（595nm），1管为空白对照管。作吸光度-蛋白浓度曲线。

管号

1

2

3

4

5

6

1.0mg/ml标准蛋白质（ml）

0

0.20

0.40

0.60

0.20

0

蒸馏水（ml）

1.00

0.80

0.60

0.40

0.80

1.00

考马斯亮蓝G-250染料（ml）

5

2样品蛋白浓度测定

准确称取豆芽1.0000g，加入用10mL研磨成匀浆后，5000转/分钟离心10分钟，将上清液转入小烧杯中。

准确吸取样品上清液1ml置干净试管中，加入考马斯亮蓝G-250染料5ml并摇匀，2～5min后比色（595nm）。对照标准曲线求出样品蛋白浓度。

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2004-11-29