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双抗夹心ELISA检测食品中大肠杆菌O157-H7方法研究
ELISAZ佳包被浓度确定包被是ELISA实验中关键的一步，如果浓度过低，包被液中的蛋白质不能完全覆盖固相载体表面，随后加入的特异性抗体和酶标二抗就有可能直接被吸附到固相载体上，Z后产生非特异性显色而使检测结果偏高；浓度过高，蛋白质分子的相互作用影响聚苯乙烯与蛋白质之间的吸附，以至在随后的抗原抗体反应、洗涤等步骤中，部分抗原或与抗体结合释放到洗涤液中被弃去，或直接释放到洗涤液中造成抗原的浪费，因此，在ELISA测定中首先要测定合适的包被浓度。双抗夹心ELISA的反应时间
在保证ELISA有效检测病原菌的前提下，快速、方便也是双抗夹心ELISA的必要条件。双抗夹心ELISA从加入待测抗原到得出结果，检测大肠杆菌O157:H7共需要5h左右，而间接ELISA则需要7h(包被37℃，2h)或者17h(包被4℃guo夜)。本论文筛选出的双抗夹心ELISA检测大肠杆菌O157:H7省去封闭这一步骤。在间接ELISA测定抗原中，封闭一般是必不可少的，因为包被不同浓度抗原不一定可以完全覆盖固相载体表面，如果不封闭，很可能使随后加入的特异性抗体和酶标二抗直接被吸附到固相载体上，产生非特异性显色而使检测结果偏高。但是对于双抗体夹心ELISA来说，在包被捕获抗体时已经使固相载体饱和，已经没有多余的吸附力来吸附随后加入的特异性抗体和酶标二抗，这都说明了双抗夹心ELISA有不需要封闭的可能，通过正交试验结果也证明不封闭可以达到理想实验效果，而且还缩短了整个检测流程和时间，说明只要酶标记物是高活性的并且操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意结果。双抗夹心ELISA检测法的特异性和灵敏性抗原抗体的结合实际上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。但这种特异性并不是的，假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可能出现交叉反应。本实验以大肠杆菌O157:H7及其他菌株共10株作为抗原用来检测本方法的特异性，结果显示大肠杆菌O157:H7呈明显阳性反应，其余各菌株均呈阴性反应，说明本方法对大肠杆菌O157:H7具有明显的检测特异性，而对所测定的其它菌株无交叉反应。
本论文所建立的双抗夹心ELISA方法对纯培养的大肠杆菌O157:H7检出限均105CFU/ml，Kerr和Chart等[6]建立的双抗夹心ELISA检测大肠杆菌O157:H7的检测限为105CFU/ml，赵志晶和刘秀梅[7]建立的双抗夹心ELISA检测大肠杆菌O157:H7的检测限为104CFU/ml，两者均用单克隆抗体作为检测抗体，而本方法使用IgY抗体与兔多克隆抗体，制备相对比单克隆抗体简单，对试剂、成本要求也相对降低，其效果基本达到检测要求。
结论本研究通过水稀释法及硫酸铵盐析法纯化抗大肠杆菌O157:H7IgY，10mg/ml纯化IgY的效价为1:320。以大肠杆菌O157:H7免疫新西兰大耳白兔，获得了抗大肠杆菌O157:H7的多克隆抗体，效价可达1:25600。确定双抗夹心ELISA检测条件的正交实验分析表明，捕获抗体于37℃包被2h、不封闭、与抗原于37℃结合2h、检测抗体浓度为0.25mg/ml、与抗原于37℃结合1h为Zyou条件。该方法稳定性、重复性良好，对纯培养菌液检出限为105CFU/ml，具有良好的敏感性及特异性，为快速检测大肠杆菌O157:H7奠定坚实基础。染菌食品在EC增菌液中培养后进行双抗夹心ELISA检测，含有0.1～1CFU/ml大肠杆菌O157:H7的样品在增菌12h后可以检出阳性反应，含有1～10CFU/ml大肠杆菌O157:H7的样品在增菌8h后可以检出阳性反应，延长培养时间对于检测结果无意义。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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