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凝胶色谱仪是利用大小不同的分子在多孔固定相（凝胶）中的选择性渗透来分离的，适用于分离分子量不同的大分子物质（Mr＞2000）。
一、洗脱顺序：
凝胶色谱中组分与凝胶之间无作用力，只是根据分子量大小来分离。凝胶是有一定孔径分布范围的多孔物质，组分进入色谱柱后，向凝胶的孔中扩散，保留程度取决于孔和组分分子的大小。小分子全部渗入小孔中，在流经色谱柱时经历的路程Z长。大分子完全被排斥在孔外，经历的路程Z短。中等大小分子渗入部分较大的孔，而被较小的孔排斥，经历的路程居中。故洗脱顺序是组分分子大小（分子量）的函数。
二、分配系数K：
组分进入色谱柱，从高浓度的流动相向凝胶的孔中扩散，扩散平衡时：
小分子一半在孔内，一半在孔外，K=1。
大分子（直径大于凝胶孔径），被全部排斥在凝胶孔隙外，K=0。
中等大小分子的直径介于以上两种极限之间，0＜K＜1。
故在凝胶色谱中，0≤K≤1。
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