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维生素B12(VB12)ELISA试剂盒使用目的：
本试剂盒用于测定食品(牛奶等)相关样本中维生素 B12（VB12）含量。
维生素B12(VB12)ELISA试剂盒实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中维生素 B12 （VB12） 水平。 用纯化的维生素 B12
（VB12）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入维生素 B12（VB12） ，再与 HRP 标记的维生素 B12（VB12）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的维生素 B12（VB12）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ，通过标准曲线计算样品中维生素 B12（VB12）浓度。
维生素B12(VB12)ELISA试剂盒组成：
1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶
2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（800ng/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份
5 显色剂 A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张
6 显色剂 B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个
维生素B12(VB12)ELISA试剂盒标本要求：
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 YZ辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
维生素B12(VB12)ELISA试剂盒操作步骤
1. 标准品的稀释： 本试剂盒提供原倍标准品一支， 用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
400ng/L 5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入 150μl 标准品稀释液
200 ng/L 4 号标准品 150μl 的 5 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
100 ng/L 3 号标准品 150μl 的 4 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
50 ng/L 2 号标准品 150μl 的 3 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
25 ng/L 1 号标准品 150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、标准孔、待测样品孔。 在酶标包被板上标准品准确加样 50μl， 待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl（样品Z终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
4. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此
重复 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同 3。
8. 洗涤：操作同 5。
9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色分钟.
10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值） 。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。
维生素B12(VB12)ELISA试剂盒计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式， 将样品的 OD 值代入方程式， 计算出样品浓度， 再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
维生素B12(VB12)ELISA试剂盒注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间Z好
控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4． 请每次测定的同时做标准曲线，Z好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值
大于标准品孔diyi孔的 OD 值） ，请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计
算时请Z后乘以总稀释倍数（×n×5） 。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
维生素B12(VB12)ELISA试剂盒保存条件及有效期：
1．试剂盒保存：2-8℃。
2．有效期：6个月
