测定意义
GS(EC6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。测定原理
GS在ATP和Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下与铁形成红色的络合物;该络合物在540nm处有Zda吸收峰,可用分光光度计测定。所需的仪器和用品
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制
提取液:30mL×1瓶,4℃保存。试剂一:10mL×1瓶,-20℃存。试剂二:10mL×1瓶,-20℃存。试剂三:粉剂×2瓶,-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂四:10mL×1瓶,4℃保存。
样本测定的准备
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水零。2、在EP管中加入下列试剂:
试剂名称(μL)
测定管对照管试剂一320试剂二320试剂三140140样本140140混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴30min
试剂四200200混匀,静置10min后,5000g,常温离心10min,取上清液测定540nm处的吸光值A。△A=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。
GS活力单位的计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
GS(U/mgprot)=ΔA×V反总÷(Cpr×V样)÷0.01÷T=19×ΔA÷Cpr
按样本鲜重计算:单位的定义:每g组织在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。GS(U/g鲜重)=ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T=19×ΔA÷WV反总:反应体系总体积,0.8mL;V样:加入样本体积,0.14mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g.
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