酶标仪高端玩家指南：搭载合成生物学传感器的可穿戴设备研发

每当凛冬来临，各种病毒病原体愈发蠢蠢欲动，走了新冠病毒来了支原体，时不时甲流乙流也来发动助攻。当下使用智能手表检测心率、血氧饱和度等已经非常普及，那么有没有更好的方式能够及时发现来袭的各种讨厌的病毒呢？放心，来自全 球各地的科学家正在火热的研究各种新鲜好玩的可穿戴传感器。

大家可能想不到，在这样一个揉合了多学科的好玩前沿领域中，名不见经传的多功能酶标仪（学名多功能微孔板检测仪），究竟能发挥什么样的作用呢？接下来，就让我们围观一下来自全 球高端玩家的玩机指南吧！

无细胞冷冻干燥可穿戴技术（wFDCF）

来自哈佛大学Wyss生物启发工程研究所和麻省理工学院的研究人员开发了一种基于 CRISPR 技术的可穿戴的合成生物学传生物感器，在无需引入活工程细菌的情况下，只需简单的水溶液暴露，即可激活该生物传感器（wearable freeze-dried, cell-free, wFDCF），从而用以检测环境中的病原体和毒素，并发出荧光信号报告。更棒的是，研究团队还将这一技术集成到了标准口罩中，以检测患者呼吸中，以及空气中是否存在 SARS-CoV-2 病毒，该技术的检测限可以与目前的实验室方法（例如 qPCR）相媲美。

在这项研究种，Agilent BioTek 的 SynergyNEO HTS 多功能酶标仪主要用于适配 wFDCF 传感器的纺织物材料的高通量筛选，以及验证基于 CRISPR 的 wFDCF 传感器用于 RNA 直接检测的有效性这两方面。

SnynergyNEO 开展纺织品中 FDCF 合成生物学反应的高通量筛选

研究团队Z初设计了一种基于比色法信号输出的 wFDCF 传感器，由三层皮肤安全材料制成的有机硅弹性体逐层组装而成，FDCF 反应传感器嵌入其中，组装好的传感器具有合适的弹性和柔韧性以支持可穿戴设计。液态样本在Z上层的入口进入后通过毛细管作用快速进入反应室。合成生物学的电路传感器输出采用 LacZ β-半乳糖苷酶操纵子，其能够水解氯酚红-β-d-半乳糖苷（CPRG），当暴露于靶标后会发生黄到紫色的变化。通过这样的巧妙设计，研究团队测试了不同的传感器模型，用于检测小分子或病毒 RNA（图 1）。

图 1：比色法信号输出的 wFDCF 传感器设计示意图

随后，研究团队深入继续深入该传感器的检测灵敏度和适用范围，将其应用于日常穿戴的纺织物中，并开发基于荧光检测信号输出的检测体系，此项工作的第 一步，便是筛选出更加适合的 FDCF 传感器纺织品载体。

筛选实验流程简介

1、先将 103 种织物样本预处理，包括去除颗粒、洗涤等，每种织物分为 BSA 封闭处理和未处理两组，干燥处理后用打孔器制成 2mm 的样本，每个样本设置三个重复，移入 384 孔板底部，对照组选择 Whatman No.4 号滤纸。

2、随后每孔内加入等量的包含 0.6mg/mL CPRG 的定制 LacZ 模板的 PURExpress 游离体外蛋白合成液，微孔板密封留孔后整板冻干。

3、冻干后的纺织物待测板子加入 ddH2O 水化至初始反应体积。

4、使用 SynergyNEO 微孔板检测仪在 37℃ 的条件下，对样本 384 孔板进行长达 12 小时的动态比色反应（OD420nm）检测，用于评价每种纺织物的 FDCF 传感器的合成生物学反应效果。

数据处理和筛选结果

动力学显色反应结束后在微孔板中可观察到明显的显色反应变化，SynergyNEO 和 Gen5 软件能够自动生成每个样本的动力学数据结果，用户后续的参数统计和分析（图 2）。通过 OD420 峰值吸收光强度、动力学平均反应速率、到达Z大信号时间、滞后时间（LagTime）等动力学参数联合纺织物密度和自发荧光等参数，设计了筛选评分，Z后研究团队选择了使用 85% 的聚酯纤维和 15% 的聚酰胺纤维的织物用于后续的荧光和发光信号输出传感器的载体（图 3）。

图 2：SynergyNEO 用于筛选 FDCF 适配的纺织物结果

图 3：wFDCF 比色纺织品筛选的归一化功能评分结果

SynergyNEO 验证 CRISPR-wFDCF 用于 RNA 直接检测的有效性

CRISPR 技术用于基因编辑领域已经是非常成熟和热门的技术，除了基因编辑，这项技术在分子检测领域也是大放异彩，早在 COVID-19 爆发不久，CRISPR 领域大神华人科学家张锋于 2020 年发表了使用 CRISPR 诊断工具检测新型冠状病毒 COVID-19 的 SHERLOCK 技术，详细介绍了标本提取和检测的方案。随后，马萨诸塞州剑桥市的夏洛克生物科学公司（Sherlock Biosciences）获得了美国食品和药物管理局 (FDA) 的紧急使用授权 (EUA)，用于检测导致 COVID-19 的病毒的 SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2 试剂盒，这是 FDA S次授权使用 CRISPR 技术。安捷伦的 BioTek SynergyNeo2 是当时市场上唯 一被批准用于 SHERLOCK SARS-CoV-2 诊断测试的微孔板读板机。

由于 SHERLOCK 技术具有灵敏度高，响应速度快、单碱基对分辨率、冻干兼容性和面向任意 DNA/RNA 序列的可编程性等诸多优点，该研究团队将此技术融入到 wFDCF 的设计中，研究团队开发了一种可以检测呼出气溶胶中 SARS-CoV-2 的口罩，只需按下病毒外侧的按钮，启动传感器内三种不同的生物反应，第 一种反应用于破坏新冠病毒的蛋白外壳，暴露其内部的 RNA；第二个反应是一个常温 PCR 扩增步骤，特异性扩增新冠病毒的刺突蛋白 （S 蛋白） 的基因片段；Z后第三个反应使用基于 CRISPR-Cas13a 的 SHERLOCK 技术来检测病毒的 S 基因，被激活的 Cas13a 将荧光-DNA 探针分子切成两个更小的片段，在口罩内部的 LAF 窗口会显示出肉眼可见的条带（图 4）。

除此之外，研究团队还继续开发了光纤网络集成的 wFCDF 传感器，能够产生更客观可靠的荧光数据信号，可以通过智能手机的 APP 实时查看该信号。

图 4：口罩式用于检测 SARS-Cov-2 的集成化可穿戴设备设计

为了验证这种融合了 SHERLOCK 技术的 wFDCF 的有效性，使用 SynergyNEO 测试了 CRISPR-Cas13a 系统直接检测病毒 RNA 的效果。

检测流程简介

1、制备 A CRISPR-Cas13a-MRSA SHERLOCK RNA 纺织品冷冻干燥样本：反应体系包含可以被 Cas13a 切割的荧光探针底物 RNaseAlert，按前述操作转入微孔板中并进行冷冻干燥。

2、使用含有 20nM mecA RNA transcript trigger 的 ddH2O 水化处理微孔板中的冷冻干燥的纺织品生物传感器。

3、将微孔板置入 SynergyNEO 中，在 30℃ 条件检测荧光信号的动力学变化 (Ex. 470 nm/Em. 528nm, 30mins)。

4、微孔板检测结果和可穿戴设备的荧光显色反应进行平行对比。

检测结果分析

对可穿戴设备的荧光显色成像结果的信号强度做均一化处理后，其动力学曲线（图 5 绿色曲线）和微孔板荧光强度曲线（图 5 红色曲线）一致，此结果提示基于此 Cas13a 酶体系的 wFCDF 传感器的可穿戴设备平台具有良好的病毒 RNA 检测效果，除此。

图 5：wFDCF CRISPR-Cas13a 生物传感器直接检测 RNA 的效果验证

SynergyNeo2 多功能微孔板检测仪推荐

SynergyNeo2 是安捷伦微孔板检测家族中的顶 级旗舰款，不仅融合了 Synergy 家族独特的 Hybrid 技术，具有独立的光路，确保在所有检测模式下均能获得出色的性能。此外其配备带宽连续可调的第四代四光栅系统，并搭载基于双平行 PMT 检测的超快速高灵敏滤光片光学模块，并且支持 TRF 激光器检测和 Alpha 激光器检测。

SynergyNeo2 主要优势

检测模式全面，包含连续波长吸收光、荧光强度检测、化学发光检测、FP、TRF、HTRF、TR-FRET、FRET、BRET、AlphaLISA 和 alphasgreen 检测模式。

独特Hybrid 光路：卓 越的检测性能保证

超快速：Z高可配置 4 个 PMT 用于超快测量

辅助检测功能丰富：包含先进的环境控制技术，温控至 70°C（这项功能在包括本文提到的 SHERLOCK 在内的恒温 PCR 技术中非常重要）和变速振荡，以支持活细胞分析。

自动化对接友好：BioStack Neo 可提供无人值守的自动化功能、高通量和条形码标记的滤光片模块，可以简化工作流程和降低出错率。

软件功能强大：Gen6 软件提供了全面的微孔板检测仪控制、强大的数据分析功能和 LIMS 集成功能。

应用范围广泛：涵盖基础研究到药物发现的多个领域应用。

参考文献

1. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. https://doi.org/10.1038/s41587-021-00950-3

2. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. https://www.nature.com/articles/s41596-019-0210-2