SPRI经典磁珠｜逆转录/体外转录/RNA-Seq纯化方案

SPRI (Solid Phase Reversible Immonilization) 固相可逆固定化是磁珠法核酸纯化的基础。依托这一技术，AMPure XP磁珠纯化方法在NGS、核酸检测、合成生物学等领域大放异彩。不只是AMPure XP，贝克曼库尔特RNAClean XP，针对转录、逆转录、RNA和cDNA合成等体外应用，可提供RNA和 cDNA纯化方案。其利用优化的缓冲液选择性地将RNA或cDNA与磁珠结合。过量的寡核苷酸，核苷酸，盐和酶可以通过简单的洗涤程序去除。RNAcleanXP卓 越的核酸回收率和纯度，可直接用于下游多项应用，已被超20种 RNA-seq 建库试剂盒建议使用，超过 1000篇文献引用。

RNAClean XP工作流

采用 RNAClean XP 纯化三个不同起始浓度的样品，0.5 ng/μL，1 ng/μL，5 ng/μL。纯化平均回收率达到75%以上。

RNAclean XP特点

• 认证的无核糖核酸酶（RNase）

• 去除盐、过量的引物和 dNTP

• 不使用有机溶剂、真空过滤或离心步骤

• 兼容手动和自动化，自动化操作友好，无离心、过滤或沉淀步骤

应用案例

应用1.

In Vitro Transcription体外转录RNA产物纯化

CRISPR sgRNA/ crRNA制备

Peter S. Solomon等1将线性化的sgRNA质粒作为模板进行体外转录。HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs)试剂盒37度18hr反应合成sgRNA。随后采用RNAClean XP磁珠纯化sgRNA产物，Qubit定量后− 20 °C保存。类似的，Pardis C. Sabeti等2同样采用RNAClean XP纯化以annealed T7 promoter oligo及DNA模板合成的crRNA产物。

Figure. Two-part gRNA和single gRNA结构. (From IDT官网)

5‘RACE IVT产物纯化

Sascha Sauer等3采用cDNA 5′末端快速扩增与深度测序（5′ RACE-Seq）评估超出+3核苷酸的序列对T7启动子活性的影响。实验发现+4和+8核苷酸之间的序列motif对转录输出影响达五倍。而这些motifs可以作为IVT反应优化的指南。其中，RNAclean XP在5′ RACE-Seq和IVT 验证实验中，帮助完成T7 RNA合成产物的纯化回收。

Figure.  5′RACE-Seq研究T7启动子受序列影响实验流程

应用2.

rRNA及DNA depletion产物纯化

许多N6-甲基腺苷（m6A）mapping方法需要大量的RNA或仅限于培养的细胞。Dahl等4开发了皮克级m6A RNA免疫沉淀和测序（picoMeRIP-seq）方法，用于单细胞和稀有细胞类型的in vivo m6A研究。在实验第 一步rRNA和DNA去除环节， NEBNext® rRNA Depletion Kit的工具酶处理后，研究人员采用RNAclean XP进行post-RNA纯化回收。值得注意的是，RNAclean XP也是 NEBNext® rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) 试剂盒中标明需使用的磁珠纯化试剂。

单细胞MeRIP–seq方法及分析pipeline

应用3.

Nanopore tRNA-Seq 文库制备

tRNA是翻译中重要元件之一。Novoa等5开发了Nano-tRNAseq。这是一种基于纳米孔的native tRNA群体测序方法，可在单个实验中提供tRNA丰度和动态修饰的定量评估。通过对纳米孔raw电流强度信号的重新处理，回收tRNA reads增加12倍，支持准确的tRNA丰度评估。Nano-tRNAseq实验过程中，研究人员则是采用贝克曼RNAclean XP磁珠完成5′ and 3′ splint adapter连接产物，逆转录后线性tRNA产物，以及ONT RMX sequencing adapter连接产物的纯化回收。

应用4.

单细胞RNA纯化

分析single B cell的B细胞受体（BCR）对了解体液免疫反应至关重要。Viant等6-7描述了一种测序，克隆和表征编码BCR抗体基因的方案。作者采用该方法分析了不同小鼠B细胞群BCR的体细胞超突变，克隆和系统发育关系以及它们对同源抗原的亲和力。实验中，采用贝克曼RNAclean XP磁珠完成流式分选单细胞的RNA纯化回收。随后将RNAclean XP洗脱获得的痕量RNA用于逆转录和重链轻链基因PCR放大。

Figure. 分离B细胞和产生单克隆抗体的方案流程

自动化加速你的

RNAclean XP实验

基于SPRI技术的RNAclean XP磁珠不需要离心或真空抽滤，自动化友好。支持适配贝克曼Biomek i-series自动化工作站，完成工作流中的RNA或cDNA纯化实验。自动化方法一旦编写、优化成型，每一次运行都会按照既定步骤一一完成，标准化你的实验流程，减少人为错误，提高实验重现性。Biomek i-series自动化系统可配置96通道加样器，同时处理RNAclean XP样品的数目可轻松突破96个样品，甚至384个样本。

RNAClean XP自动化工作流及时间预估

RNAClean XP自动化方法预览

Biomek method launcher可将方法归类，提示实验所需每种试剂、耗材的摆放指引。方法选项选择器 MOS则可提供特定于样品通量、液体体积、时间、洗涤次数等过程选项和工作流定制的灵活性。帮助你自动化高通量的纯化实验，加速研究进程。