重组多顺反子逆转录病毒介导的人载脂蛋白AI 与卵磷脂胆

目的：载脂蛋白AI(apolipoprotein, apoAI)与卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(lecithin:cholesterol acyltransferase, LCAT)作为高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)的主要组分，在胆固醇由周围组织向肝脏的运输排泄过程即胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport, RCT)过程中起关键作用近年研究进一步证实，ApoAI与LCAT的转基因动物能纠正由于遗传缺陷所致的低HDL血症并有效抵抗高脂食物引起的致动脉粥硬化(atherosclerosis, As)作用因此，ApoAI与LCAT已成为As基因ZL中较有希望的目的基因骨骼肌量大，血管丰富，位于体表易于操作，且能够合成和分泌非肌性蛋白在骨骼肌外发挥作用，是基因ZL中理想的靶器官ApoAI与LCAT均属分泌性蛋白质，在肌细胞异源表达后应能分泌入血，通过增强体内RCT过程，发挥其抗As的作用基于以上原理，本研究以重组多顺反子逆转录病毒为载体，将人apoAI与LCAT基因转导入培养的小鼠肌源性细胞中，探讨其在肌源性细胞中的表达并分泌入血的可能性，为发展动脉粥样硬化基因ZL新方法奠定基础方法：本实验室S次构建成功含人apoAI cDNALCAT cDNA和新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase, Neo)基因的三顺反子重组逆转录病毒表达载体pLAPLEN和含LCAT cDNA和Neo基因的双顺反子重组逆转录病毒表达载体pLLEN，各基因之间以细小病毒内部核糖体入口片段(internal ribosomal entry site, IRES)进行连接用pLAPLEN与pLLEN等重组质粒转化JM109大肠杆菌，经扩增抽提及纯化后，以磷酸钙沉淀法将其转导入包装细胞GP+E-86与AM12，用G418(Geneticin)筛选及扩增后挑选出抗性细胞克隆，通过NIH3T3细胞进行滴定以鉴定出GX产病毒的包装细胞细胞株以其分泌的重组复制缺陷型病毒颗粒感染小鼠原代肌母细胞及肌源性细胞C2C12，一部分以低血清培养促其分化为肌管细胞，另一部分细胞以G418筛选成为稳定转染的C2C12细胞克隆按不同时间收集无血清细胞培养液，以ELISA法检测其中人apoAI的含量，以［3H］-胆固醇标记底物的放射化学法检测人LCAT的活性提取稳定转染的C2C12细胞的基因组DNA，以PCR法检测目的基因的转移效率与整合情况同时以细胞免疫组化方法直观检测C2C12细胞的apoAI与LCAT的表达情况结果：以质粒pLAPLEN和pLLEN转导入包装细胞后，经筛选及滴定均获得GX表达的产病毒细胞株，病毒滴度达105-106 cfu/mL，用以检测病毒滴度的NIH3T3细胞培养液中亦被检出有人apoAI与LCAT的表达转染后的小鼠原代肌母细胞及C2C12细胞在分化为肌管细胞后仍保持异源表达人的apoAI与LCAT的能力经G418筛选则获得稳定转化的C2C12细胞株，60 d后仍能有效表达人apoAI与LCAT稳定转化的C2C12细胞株在60 d时提取其细胞基因组DNA，PCR法检测显示人apoAI cDNA与IRES基因均有效整合基因组中细胞免疫组化方法检测结果表明几乎1**%的稳定转化的C2C12细胞于传代后3个月仍能有效表达人apoAI与LCAT结论：以上结果充分表明，以重组多顺反子逆转录病毒为载体，将人apoAI与LCAT基因转导入小鼠原代肌母细胞和肌源性细胞C2C12，均能有效表达apoAI与LCAT并分泌出细胞说明以重组逆转录病毒为载体经间接体外方法(ex vivo)对肌源性细胞进行遗传修饰后再移植回骨骼肌内可能是一种在体内GX持久表达apoAI和LCAT从而防止和/或减轻动脉粥样硬化的安全和有效的方法