使用Beacon Analytical Systems三聚氰胺孔板试剂盒和Molecular Devices光吸收酶标仪进行高通量三聚氰胺检测

介绍
有机碱三聚氰胺用于制造许多产品，包括塑料、阻燃剂、颜料和化肥。最近在动物饲料和人类食用食品中添加三聚氰胺以增加蛋白质含量的做法已被报道。由于三聚氰胺污染可导致动物和人的严重疾病或死亡，人们对确定检测各种食品中三聚氰胺污染的方法越来越感兴趣。

在此应用说明中，我们介绍和验证了 Beacon AnalyticalSystems 公司的三聚氰胺孔板试剂盒。Beacon 三聚氰胺孔板试剂盒是一种竞争性的酶联免疫吸附试验 (ELISA)，用于对污染样品中的三聚氰胺进行定量分析。使用该试剂盒可检测多种样品类型，包括乳制品、麦麸和干湿宠物食品。三聚氰胺是通过与提取液混合或震荡从样品中提取出来的。然后将三聚氰胺 HRP 共轭物，样品提取物和校准物吸移到包被了三聚氰胺抗体的测试孔中。 孵育 30 分钟后，将孔洗涤以除去未结合的三聚氰胺，然后将底物添加到孔中。30 分钟后停止反应，并使用带有光吸收功能的酶标仪测量孔的吸光度。测试样品的三聚氰胺浓度由三聚氰胺标准曲线计算得到。
来自 Molecular Devices 的光吸收酶标仪用于检测三聚氰胺测定实验中的吸光度。Molecular Devices 的AquaMax4000 微孔板清洗机同时吸出并分配所有微孔板孔，以快速完成所需的清洗步骤。数据收集和分析使用 SoftMaxPro GxP 软件中的三聚氰胺 ELISA 预先设置的模板，SoftMaxPro GxP 软件是符合 FDA 21 CFR Part 11 的行业标准分析软件。

材料
具有光吸收检测模式的 Molecular Devices酶标仪：
• SpectraMax Plus 384 (cat. #PLUS 384)
• SpectraMax 190 (cat. #190)
• SpectraMax 340PC384 (cat. #340PC 384)
• VersaMax™ (cat. #VERSAMAX)
• SpectraMax M2/M2e (cat. # M2 or M2E)
• SpectraMax M5/M5e (cat. #M5 or M5E)
• FlexStation 3 (cat. #FLEX3)
• SpectraMax i3x (cat. #i3x)
• SpectraMax iD3 (cat. #iD3)
Molecular Devices AquaMax 4000 微孔板清洗机( 按需配置 )三聚氰胺孔板试剂盒 (Beacon AnalyticalSystems, cat. #20-0158)

优势
• 三聚氰胺污染检测的质量保证筛选方案
• 降低人工操作的处理方式提高其通量
• 使用 SoftMax Pro GxP 软件进行完整的数据分析
方法
采用以下测试步骤 (1)：
• 在进行测试之前，让试剂达到室温。
• 将适当数量的包被有三聚氰胺抗体的测试孔放在微孔支架中。 将剩余的测试孔重新密封在提供的拉链袋中。 将另外的非抗体包被的孔置于微孔架中，以使所有 96 个位置均被占据。这样就可以使用 AquaMax4000 微孔板清洗机，该清洗机可以一次清洗所有 96 孔。
• 使用带有一次性吸头的移液器将 150 µL校准品 ( 一式三份 ) 或稀释的样品提取物添加到适当的测试孔中。每个都使用干净的移液器吸头。
• 向每个孔中添加 50 µL 三聚氰胺 HRP 共轭物。
• 将板轻轻震荡 60 秒，然后在室温下孵育30 分钟。
• 抽吸孔中的内容物，并使用 AquaMax4000 微孔板清洗机分配 250 µL 洗涤溶液(1x PBS / 0.05％Tween-20)，总共进行四个抽吸/分配循环。
• 最后一次洗涤后，将倒置的平板轻拍到吸水纸上以去除残留的洗涤液。
• 将 100 µL 底物分配到每个测试孔中，并将板在室温下孵育 30 分钟。
• 将 100 µL 终止溶液分配到每个测试孔中。
• 使用 SoftMax Pro 软件中预先设置的模板，在 VersaMax 酶标上于 450 nm 读取测试孔的吸光度。
• 使用 SoftMax Pro 软件绘制校准物曲线。
结果
光密度 (OD) 值用于构建标准曲线。 将校准物绘制为校准物的 OD 值 ( y 轴 ) 与校准物浓度的对数 ( x 轴 ) 的关系。 然后可以通过插入标准曲线公式计算样品三聚氰胺含量。OD 值大于最低校准物或小于最高校准物的样品必须分别报告为 < 20 ppb 或 >500 ppb。

图 1 显示了如上所述绘制的三聚氰胺标准曲线，并带有 4 参数曲线拟合。 图 2 显示了使用半对数曲线拟合绘制的三聚氰胺标准品。通常，4 参数曲线在标准曲线的高端和低端具有更好的拟合度，因此是可取的。
表 1 总结了三聚氰胺孔板试剂盒校准物的数据。使用产品插页中概述的测试步骤以及用于所需洗涤步骤的AquaMax4000 微孔板清洗机，观察到了不到 5％ 的出色CV。
结论
Beacon Analytical Systems 公司的三聚氰胺平板试剂盒与 Molecular Devices 公司的 SpectraMax、VersaMax、VMax 和EMax 酶标仪一起，提供了一种质量保证的筛选解决方案，用于检测食品中的三聚氰胺污染物，例如牛奶、奶粉、酸奶、小麦面筋以及潮湿和干燥的宠物食品。MolecularDevices 的 AquaMax 4000 微孔板清洗机可实现 ELISA 清洗步骤的自动化，拥有出色的重现性，并可与 StakMax微孔板处理系统集成以提高通量。用户还可以将StakMax 系统与 SpectraMax 和 VersaMax 酶标仪一起配置，以最大程度地减少手动平板的操作。 完整的数据分析由符合FDA 21 CFR Part 11 的行业标准分析软件SoftMax Pro GxP 提供。