乳制品中L-羟脯氨酸的测定

样品水解

(1)称取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（2.1.3），加入蛋白水解试剂（2.2.9），旋紧盖子，振荡混匀，110 °C下反应24 h。

(2)反应完毕，将反应液全部转移至100 mL蒸馏瓶中，75℃下减压蒸馏至近干。

(3)用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液（2.2.10）分三次溶解残渣，并转移到20 mL玻璃具塞刻度试管（2.1.5），再用纯水定容至20 mL，待衍生。

样品衍生 异硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法

（1）样品水解溶液衍生 量取200 μL样品水解溶液，置于1.5 mL塑料离心管中，加入100 μL三乙胺溶液（2.2.12）和100 μL衍生剂PITC溶液（2.2.11），混匀，             室温反应1h，加入400μL正己烷（2.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μL下层溶液与800 μL水混合，经0.22 μm针式过滤器（2.1.7）             过滤，待分析。

（2） 标准溶液衍生化 量取200 μL L-羟脯氨酸使用液*（2.2.16），置于1.5 mL塑料离心管中，加入100 μL三乙胺溶液（2.2.12）和100 μL衍生剂PITC溶液                   （2.2.11），混匀，室温反应1h，加入正己烷400 μL（2.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μL下层溶液与800 μL水混合，经0.22 μm针             式过滤器（2.1.7）过滤，待分析。 

*根据实际情况，氨基酸使用液浓度可进行调整，本方法中氨基酸使用液浓度仅供参考。 2,4-二硝基氟苯（DNFB）衍生方法

（1） 样品溶液衍生 取0.5 mL样品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度试管（2.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液（2.2.14）和0.5 mL衍生剂DNFB溶液                   （2.2.13），具塞摇匀，于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（2.2.17）定容至5 mL，混匀后经0.22 μm针式过滤器          （2.1.7）过滤，待分析。

（2） 标准溶液衍生 取0.5 mL L-羟脯氨酸使用液（2.2.16）置于5 mL玻璃具塞刻度试管（2.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液（2.2.14）和0.5 mL衍生剂           DNFB溶液（2.2.13），具塞摇匀，于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（2.2.17）定容至5 mL，混匀后经0.22 μm          针式过滤器（2.1.7）过滤，待分析。

异硫氰酸苯酯（PITC）衍生色谱条件

色谱柱: Diamonsil AAA 250×4.6 mm，5 μm（Cat.#：99751）

流动相A: 0.05 mol/L乙酸钠水溶液（冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05）

流动相B: 甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20（V : V : V）

流速: 1.0 mL/min 检测波长: UV 254 nm 柱温: 45 ℃

进样体积: 10 μL 梯度程序 T/min 0 39 40 45 46 60 A/% 95 52 0 0 95 95 2,4-二硝基氟苯（DNFB）

衍生色谱条件 色谱柱: Diamonsil AAA 250×4.6 mm，5 μm（Cat.#：99751）

流动相A: 0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液

流动相B: 甲醇 : 乙腈=10 : 90 （V : V）

流速: 1.0 mL/min

检测波长: UV 360 nm

柱温: 35 ℃

进样体积: 10 μL 梯度程序 时间/min 0 39 44 44.01 65 流动相A/% 86 60 30 86 86