解决方案

乳制品中L-羟脯氨酸的测定




方法:

HPLC



基质:

奶及奶制品



应用编号:

103012



化合物:

L-羟脯氨酸





色谱柱:


Diamonsil AAA 5μm 250x4.6mm




样品前处理:


样品水解



(1)称取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中(2.1.3),加入蛋白水解试剂(2.2.9),旋紧盖子,振荡混匀,110 °C下反应24 h。



(2)反应完毕,将反应液全部转移至100 mL蒸馏瓶中,75℃下减压蒸馏至近干。



(3)用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液(2.2.10)分三次溶解残渣,并转移到20 mL玻璃具塞刻度试管(2.1.5),再用纯水定容至20 mL,待衍生。



样品衍生 异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法



(1)样品水解溶液衍生 量取200 μL样品水解溶液,置于1.5 mL塑料离心管中,加入100 μL三乙胺溶液(2.2.12)和100 μL衍生剂PITC溶液(2.2.11),混匀,             室温反应1h,加入400μL正己烷(2.2.3),旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μL下层溶液与800 μL水混合,经0.22 μm针式过滤器(2.1.7)             过滤,待分析。



(2) 标准溶液衍生化 量取200 μL L-羟脯氨酸使用液*(2.2.16),置于1.5 mL塑料离心管中,加入100 μL三乙胺溶液(2.2.12)和100 μL衍生剂PITC溶液                   (2.2.11),混匀,室温反应1h,加入正己烷400 μL(2.2.3),旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μL下层溶液与800 μL水混合,经0.22 μm针             式过滤器(2.1.7)过滤,待分析。 



*根据实际情况,氨基酸使用液浓度可进行调整,本方法中氨基酸使用液浓度仅供参考。 2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生方法



(1) 样品溶液衍生 取0.5 mL样品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度试管(2.1.6)中,加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液(2.2.14)和0.5 mL衍生剂DNFB溶液                   (2.2.13),具塞摇匀,于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却,用磷酸盐缓冲溶液(2.2.17)定容至5 mL,混匀后经0.22 μm针式过滤器          (2.1.7)过滤,待分析。



(2) 标准溶液衍生 取0.5 mL L-羟脯氨酸使用液(2.2.16)置于5 mL玻璃具塞刻度试管(2.1.6)中,加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液(2.2.14)和0.5 mL衍生剂           DNFB溶液(2.2.13),具塞摇匀,于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却,用磷酸盐缓冲溶液(2.2.17)定容至5 mL,混匀后经0.22 μm          针式过滤器(2.1.7)过滤,待分析。




色谱条件:


异硫氰酸苯酯(PITC)衍生色谱条件



色谱柱: Diamonsil AAA 250×4.6 mm,5 μm(Cat.#:99751)



流动相A: 0.05 mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05)



流动相B: 甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20(V : V : V)



流速: 1.0 mL/min 检测波长: UV 254 nm 柱温: 45 ℃



进样体积: 10 μL 梯度程序 T/min 0 39 40 45 46 60 A/% 95 52 0 0 95 95 2,4-二硝基氟苯(DNFB)



衍生色谱条件 色谱柱: Diamonsil AAA 250×4.6 mm,5 μm(Cat.#:99751)



流动相A: 0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液



流动相B: 甲醇 : 乙腈=10 : 90 (V : V)



流速: 1.0 mL/min



检测波长: UV 360 nm



柱温: 35 ℃



进样体积: 10 μL 梯度程序 时间/min 0 39 44 44.01 65 流动相A/% 86 60 30 86 86




文章出处:

迪马实验室



关键字:

乳制品;L-羟脯氨酸;hplc;Diamonsil AAA




图谱:






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