沪鼎生物免疫沉淀技术服务流程-上海沪鼎生物科技有限公司

资料简介：

免疫沉淀反应主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Westernblotting分析。免疫沉淀操作流程（以ProteinAAgarose方法为例）：一、蛋白样品的准备1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。3.对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。二、去除非特异性结合1.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的ProteinAAgarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。2.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。三、免疫沉淀1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动放置一个晚上。2.再加入20微升充分重悬的ProteinAAgarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉ProteinAAgarose。4.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤。5.完成Z后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。6.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。免疫共沉淀：参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。