同源重组一步法无缝克隆试剂盒One Step Cloning Kit

Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重组克隆试剂盒，精心优化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了独特的重组增强因子，用于同源重组可显著提高重组克隆效率。

该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，兼容未纯化PCR产物、直接回收的PCR产物、低浓度的胶回收产物，本产品可重组同源臂GC含量30%-70%的接头片段。将载体完全线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，在50℃条件下zui快仅需5 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

组分信息

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

简版使用说明

 1.重组反应

   1)线性化载体和插入片段使用量

Hieff Clone®重组反应体系各个片段及载体插入总浓度为0.02 - 1 pmol。载体与各个插入片段摩尔比为1:2*。对应的DNA质量可由以下公式计算获得：

pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入碱基对数 × 650 daltons)
50 ng 5,000 bp的DNA片段约为0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段约为0.15 pmol

*当插入片段长度大于载体时，zui适载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即插入片段当做载体，载体当做插入片段进行计算。线性化载体及插入片段的反应终浓度可达到1 ng/μL。线性化载体和插入片段扩增产物未纯化直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。

简便的投入量计算公式：插入片段投入量=2×插入片段长度×插入载体投入质量/载体长度

 2)重组反应体系（可等比扩大或缩减反应体系，冰上配制，各组分使用前需混匀）

表1 反应体系

3)重组反应条件

1. 体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。

2. 当插入1个片段时，反应条件为50℃，5 min；当插入片段数为2-6个时，建议反应条件为50℃，10 -50 min（反应时间随片段数增多而延长，如表2所示）。超长载体片段连接，建议反应时间为40-60 min。

表2 反应时间

3. 反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

2. 转化

1. 提前15分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热。

2. 在冰上解冻快速克隆感受态细胞（如：DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）。

3. 取10 μL冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置5 min。

4. 用200 μL移液枪将上一步的混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上，均匀涂布。

5. 将平板置于37℃培养箱倒置过夜培养。若进行蓝白斑筛选操作，平板在37℃至少倒置培养15 h。

3. 克隆鉴定

zui方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至菌落PCR Mix中混匀（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接进行PCR反应。推荐至少使用一条通用测序引物进行菌落PCR，可以避免PCR假阳性的产生。后续也可用于酶切或测序鉴定。

注意事项

1.需自备的材料：

     1)自备样品：自备好线性化载体和插入片段。

     2)自备试剂（仅罗列部分）：

1. 超级感受态：转化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α快速化学感受态细胞（Cat#11803ES）。

2. 高保真酶：2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效产品。

3. 菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效产品。

4. 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效产品。

     3）自备仪器耗材（仅罗列部分）：PCR仪，水平电泳槽，切胶仪，EP管等。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 本产品仅作科研用途！

Ver. CN20231024