Hifair® Ultra Reverse Transcriptase是对Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase进行基因工程改造的全新逆转录酶，该酶缺乏RNase H活性，合成全长cDNA的能力大幅提升，可扩增长达20 kb的cDNA。Hifair® Ultra Reverse Transcriptase的热稳定性显著提高，耐受温度达65℃，可对具有复杂二级结构的RNA模板高效逆转录。与Hieff® M-MLV (H-) Reverse Transcriptase相比，Hifair® Ultra Reverse Transcriptase具有更高的持续合成能力及合成速率，同时增强了耐抑|制剂的能力，可有效解决样品中的抑|制剂导致逆转录效率低下的问题。
产品组分
编号 | 组分 | 产品编号/规格 | ||
14604ES84 (2000 U) | 14604ES92 (10000 U) | 14604ES98 (200000 U) | ||
14604-A | Hifair® Ultra Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 10 μL | 50 μL | 1 mL |
14604-B | 5×Hifair® Ultra Reverse Transcriptase Reaction Buffer | 50 μL | 250 μL | 5×1 mL |
产品应用
全长cDNA文库构建；
终点法PCR；
RT-PCR及实时定量RT-PCR等。
运输与保存方法
干冰运输，-20ºC保存，有效期一年。
注意事项
1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染；
2）所有操作均应在冰上进行，防止发生RNA降解；
3）为保证逆转录成功，建议使用高质量的RNA样本；
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5）本产品仅用作科研用途！
一链cDNA合成操作步骤
1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高一链cDNA的产量。）
组分 | 使用量 |
RNase free ddH2O | to 13 μL |
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM) | 1 μL |
or 1 μL | |
or 1 μL | |
模板RNA | Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:1 pg-500 ng |
65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应液配制
组分 | 使用量 |
上一步的反应液 | 13 μL |
5×Hifair® Ultra Reverse Transcriptase Reaction Buffer | 4 μL |
dNTP Mix (10 mM) | 1 μL |
Hifair® Ultra Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 μL |
RNase Inhibitor (40 U/µL) | 1 μL |
3. 逆转录程序设置
温度 | 时间 |
25℃ | 5 min |
50℃ | 15 min |
85℃ | 5 min |
【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略；
2）逆转录温度：推荐使用50℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到55℃-60℃；
3）85℃加热5 min，目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
HB221114
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
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