恙虫IgG检测试剂盒

恙虫IgM检测试剂盒

恙虫又名丛林斑疹伤寒，是由恙虫东方体（恙虫立克次体）引起的急性传染病，系一种自然疫源性疾病，啮齿类为主要传染源，恙螨幼虫为传播媒介。

1、应用范围

恙虫IgG ELISA试剂盒可用来检测人是否感染恙虫东方螺旋体（OT），它是检测血浆或血清中抗恙虫东方螺旋体源性重组抗原的IgG抗体的一种ELISA检测系统。此实验可辅助诊断人是否感染了恙虫东方螺旋体，此试剂盒不能用于筛查血液或血液成分，仅供体外诊断用。

2、前言说明

    恙虫是一种由恙虫东方体引起的传染病，恙虫东方体一种约细菌大小的寄生虫，隶属于立克次氏体科。如果被幼虫状态的恙螨（啮齿目的寄生虫）咬了，就会传染恙虫。被恙螨咬后的典型表现是皮肤溃疡，之后会出现高烧、全身斑点皮疹和淋巴结肿大。人在接触二级营养体后，一般都会出现恙虫。但是这种疾病也流行于沙漠、高山和热带地区。恙虫是一种世界性的疾病，但主要存在于东南亚和西太平洋。在东南亚的一些地区，大约20%的疾病都是由恙虫引起的，并且是地方性的。在最初被咬后，疾病大概会持续10至20天。如果加以治疗，则高烧会在36小时内退去，但如果不治疗的话，则会出现并发症乃至死亡。

3、实验原理

恙虫IgG ELISA试剂盒是一种定量检测人血清和血浆中抗OT IgG抗体的酶免试剂。包被板的微孔中包被了重组抗原混合物（如下）。在检测的时候，血清应当用Inbios的样品稀释液稀释后再加入微孔中，具体请见如下的“血清应用范例”。在温育并洗板后，在微孔中加入HRP标记的IgG酶联物。温育并洗板，再向微孔中加入TMB底物液并温育。后再加入酸性终止液，并在450nm检测底物反应的程度。所检测到的OD值与样品中IgG抗体的浓度成正比。阴性质控和弱阳性质控以内在质控形式提供，其目的是为了监测试剂盒成分的完整性。如果样品与抗原间发生了反应，则样品应当被认为是阳性的。

4、试剂盒成分

恙虫IgG ELISA试剂盒提供了足够做96人份所需要的试剂。试剂盒成分如下：

恙虫检测特定材料：

1）恙虫检测抗原包被的包被板：带板盖的板架，恙虫东方体（OT）源性重组抗原包被的96孔包被板。2-8℃下储存，有效期内稳定。

2）样品稀释液：1瓶，15ml，用于样品稀释。可能会出现沉淀，使用前轻轻混合。2-8℃下储存，有效期内稳定。

3）HRP标记的即用型酶联物：1瓶，6ml，内含即用型的HRP标记的抗人IgG溶液。2-8℃下储存，有效期内稳定。

4）TMB底物液：1瓶，9ml液态底物液，2-8℃下储存，有效期内稳定。注意：底物液必须始终储存于避光试剂瓶中。

5）终止液：1瓶，内含6ml即用型的终止液，2-8℃下储存，有效期内稳定。

6）10倍浓缩的洗涤液，1瓶，120ml，2-8℃下储存，有效期内稳定。

7）EnWash：1瓶，20ml EnWash溶液，在加酶联物后的洗板步骤间使用。2-8℃下储存，有效期内稳定。

8）阴性质控：1支，30ul热灭活阴性血清，阴性质控可辅助监测试剂盒的完整性，储存于-70℃的环境下。

9）阳性质控：1支，30ul热灭活阳性血清，阳性质控可辅助监测试剂盒的完整性，储存于-70℃的环境下。

注意：实验开始前，所有的试剂和质控都必须平衡至室温，反复倒置使溶液混合均匀。

5、实验所需器材但试剂盒不提供

1）可在450nm处读数的酶标仪

2）生物学或高纯度水

3）37℃无二氧化碳的湿度孵育箱

4）洗板机

5）1-10ul的单道移液器，50-200ul的单道和多道移液器。

6）计时器

6、样品的采集与准备

1）此实验必须用血清来做。全血和血浆样本不能直接检测。

2）为了避免溶血，应当从凝固的红细胞中尽快分离出血清。

3）样品采集后应当尽快检测掉，不要让血清在室温下停留过长时间。

4）实验要使用血清，采血时注意静脉采血的常规注意事项。样品可在2-8℃下存放7天，冻存于-20℃或更低温度时可存放30天。为了延长血清的有效期，我们可以将其冻存于-70℃的环境下。避免反复冻融样品。

5）不要使用溶血的或脂血样品。

6）实验开始前，将冻存的样品融解至室温，并旋涡或倒置混合样品。

7）如果血清需运输，必需密封于容器，贴上联合管制的标签作为传染性物质运输。

7、实验步骤

使用前，将所有的试剂成分和样品都平衡至室温。实验前反复倒置以便试剂和样品混合均匀。

试剂准备：

1）即用型洗涤液的配置：用生物学或高纯度水将10倍浓缩型的洗涤液稀释成即用型的洗涤液。为了制备即用型的洗涤缓冲液，我们可以将120ml 10倍浓缩的洗涤液加入到1080ml蒸馏水或去离子水中，冲洗掉所有晶体，旋涡混合溶液以至所有晶体都溶解掉。制备好的洗涤液可在室温下稳定储存4个月。注意：如果洗涤液里有微生物生长，则应当弃取。

2）包被板的准备：将实验所需数目的板条置于板架上。将剩余的板条立即装入包装待中，并储存于2-8℃的环境下，有效期内稳定。
注意：长期储存的血清样品不能反复冻融，血清可以储存于-70℃的环境下。

操作步骤：

将所有的试剂成分和样品都平衡至室温。实验前反复倒置以便试剂和样品混合均匀。阳性质控、阴性质控和未知血清都必须做双份检测。

1）确定好所需检验的血清样品量。

2）按照如下的“血清应用范例”组织血清样品（仅供参考，用户也可以自己设置相应的位置），用户可以杂试管或ELISA塑料板内稀释样品。

3）用样品稀释液将样品稀释50倍（您可以在8ul的血清中加入392ul样品稀释液），混合。注意：血清和质控品不能低于4ul。

4）用移液器将稀释好的血清和质控各50ul加入到相应的微孔中。

5）用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。

注意：这样是为了保证温度的分布在每个孔的底部和血缘相等地散播。一旦顶部密封阻碍了蒸发，任何多余的封板胶必需被剪掉。

6）37℃下保湿温育板条30分钟，在温育器的底部放置水浴箱可达湿润的作用。注意：不要将微孔板叠放，必须单独地分层平辅。这对于温度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何气体，不要让板条接触任何湿润的物质，如湿纸巾等。

7）温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

8）在每一微孔中加入50ul即用型的酶联物。

9）用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。（同步骤5）

10）     37℃下保湿温育板条30分钟。（同步骤6）

11）     温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

12）     用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。

13）     室温温育5分钟。

14）     温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

15）     用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。

16）     室温避光温育10min。

17）     温育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul终止液，室温温育1min。

18）     温育后，450nm处测    OD值。

8、临界值的计算和结果说明

临界值的计算：将没有受感染的正常人血清的平均OD值+3SD来确定临界值。例如：临界值=平均OD值+3SD。下面临界值是用印度人的正常血清检测得到的，临界值：0.370

注意：上述临界值并不是用很多人群检测得到的，所以，我们建议用户能建立自己地域内的临界值。

结果说明：

1） OD值高于临界值的样品被认为是有活性(阳性)的样品，低于临界值的样品被认为是无活性（阴性）的样品。

2）  有活性的（阳性）样品必须重复检测来确定结果是否正确，靠近临界值的数值被认为是可疑样品，此类样品也必须重复检测（做三份或更多份）。

总结：

实验必须满足如下表格中的要求：以下标准不能完全满足说明试剂可能已退化或操作出现了错误，并且实验必须重做。

本译文仅供由华南生物工程有限公司研究人员编译，仅供参考，详情请以原文为准