Xenium原位分析技术助力发现罕见的癌症生物学特征

在您试图了解肿瘤侵袭性的差异时，很容易错过那些隐藏在复杂肿瘤微环境中的微小异质性，比如上图乳腺癌样本中的一小块三阳性区域。在这篇文章中，我们将讲述Xenium原位分析技术如何发现这种被其他方法遗漏的独特的癌症生物学特征。

两个看似相同的肿瘤

一个肿瘤是非侵袭性的，相对无害

另一个却逐渐形成侵袭性，变成有害的侵袭性肿瘤

为什么？

答案很简单：异质性，但异质性本身却并不简单...

尽管癌症是Z臭名昭著的例子，但患者之间和患者自身的异质性是所有疾病面临的难题。事实上，即使在健康状态下，绝大多数的人类生物学功能的正常行使也需要细胞异质性。细胞异质性的评估因几方面的挑战而变得复杂。首先，小的分子波动可能导致大的功能变化(1)。其次，基因组水平的异质性可能不会转化到转录组、蛋白质组或结构水平，反之亦然(2)。此外，空间背景会大大影响异质性。异质性很难用传统方法来解析，但在将单细胞数据的强大分辨率与空间转录组数据提供的形态学背景相整合后，研究人员在捕捉这种复杂生物学现象的驱动因素方面取得了很大进展。这种方法计算量大，仍然依赖于推断而不是直接观察。尽管这些整体转录组分析对科学探索很有帮助，但仍需要深入研究这些方法所发现的感兴趣基因，才能真正了解其意义。那么，如果有一种方法能够将单细胞分辨率的力量与空间基因表达的形态学背景融合到单个实验中，又会怎么样？

想象一下，您是一名研究人员，上图这份导管原位癌（DCIS）样本正出现在您的工作台上，并有机会采用Xenium原位分析。您会在分析中发现什么？根据H&E染色后的传统组织病理学评估，这份乳腺肿块粗针穿刺活检样本被注释为HER2+/ER+/PR- (4)。也就是说，这份样本表达人类表皮生长因子受体2（HER2/ERBB2）和雌激素受体（ER/ESR1），但不表达孕酮受体（PR/PGR）。为了生成亚细胞分辨率的基因表达图谱，我们采用高度特异且灵敏的可环化锁式探针来检测感兴趣的RNA转录本。这个样本经过10x Genomics公司Xenium人类乳腺基因表达panel（包含313个基因的探针）处理，反映了以往在单细胞图谱数据中描述的致瘤和健康人类乳腺组织的状态(5-7)。

回顾图2A所示的Xenium空间结果中的ESR1、ERBB2和PGR表达，发现所分析的组织切片的大部分区域同时表达ERBB2和ESR1转录本（HER2/ER双阳性），或只表达ERBB2转录本（HER2阳性）。然而，Xenium也发现了一小块区域，大约5.5 mm x 7.5 mm，呈现出ERBB2、ESR1和PGR转录本的三阳性表达（HER2+/ER+/PR+；图2A-D）。考虑到受体状态可用来预测患者预后，鉴定这个独特的三阳性区域的能力有多重要，相信已经不言而喻。

为了全面研究组织生物学，Xenium原位分析将强大的单分子RNA测序与空间解码技术相结合，能够以亚细胞分辨率快速检测整张组织切片中的数百个至数千个RNA靶点。这种类型的分析不仅能在生物学背景下对细胞进行定位和分型，还能解决细胞间通讯的问题，分析细胞微环境并鉴定罕见的细胞浸润。Xenium通过独特的四因素认证化学方法，带来了高特异性。每个靶点都是利用挂锁式探针鉴定的。

这些探针必须满足以下条件：

两条臂与靶点稳定杂交（第1步和第2步）

探针末端彼此连接，形成一个环状探针（第3步）

成功完成这个环状探针的滚环扩增（第4步）

这种方法的灵敏度很高，足以区分高同源性的RNA，并检测低表达的转录本。Xenium高灵敏度的化学方法与亚细胞空间分辨率的组合对于这种三阳性区域的检测至关重要。

在检测过程中，荧光标记的探针自动进入循环、孵育、成像，并被仪器去除。在仪器运行结束后，数据即被整合，建立起整张组织切片的转录本空间图谱。Xenium对整张组织切片的高分辨率分析是促成这个（三阳性）区域被鉴定出的另一个重要因素。在此次分析中，三阳性区域大约只有0.1 mm2，而总面积为42 mm2。这个稀疏的区域对非靶向或低分辨率方法来说是一大挑战。此外，由于一些空间技术只能对实验前预先选择的感兴趣区域进行分析，那么这个小区域就很容易被忽略，因为以往没有办法知道它包含独特的生物学特征。

Xenium原位分析的另一个强大优势在于它能够在Xenium运行后对同一组织切片进行免疫荧光染色（图4）。这种功能之所以能够实现，是因为仪器上非破坏性的生化和解码循环保留了蛋白质表位。尽管一些空间技术能够提供RNA和蛋白表达的分析，但其中许多需要使用连续的载玻片来分析不同的分析物类型，这使得分析物无法同时实现大规模可视化。在Xenium处理过程中，组织的完整性得以保留，这意味着在Xenium处理后也可以进行H&E染色（图2C）。获得同一张组织切片的组织病理学、蛋白表达和基因表达数据，可帮助您更全面地了解样本的生物学特征。

在探究肿瘤是否会继续保持良性还是转变成侵袭性这样的复杂生物学问题时，大海捞针有时似乎比破译癌症背后的分子机制要简单一些。然而，每一个新的生物学机制都有可能改变我们诊断癌症的方式，甚至在某一天还能治愈癌症。

参考资料：

1. Chang AY & Marshall WF. Organelles – understanding noise and heterogeneity in cell biology at an intermediate scale. J Cell Sci 130: 819–826 (2017). doi: 10.1242/jcs.181024

2. Goldman SL, et al. The impact of heterogeneity on single-cell sequencing. Front Genet 10: 8 (2019). doi: 10.3389/fgene.2019.00008 

3. Moses L & Pachter L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods 19: 534–546 (2022). doi: 10.1038/s41592-022-01409-2 

4. Janesick A, et al. High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue. bioRxiv (2022). doi: 10.1101/2022.10.06.510405 

5. Pal B, et al. A single-cell RNA expression atlas of normal, preneoplastic and tumorigenic states in the human breast. The EMBO Journal. 40: e107333 (2021). doi: 10.15252/embj.2020107333 

6. The American Cancer Society. (2021, November 8). Breast cancer hormone receptor status. Understanding a breast cancer diagnosis. Retrieved April 13, 2023, from https://www.cancer.org/cancer/breast-cancer/understanding-a-breast-cancer-diagnosis/breast-cancer-hormone-receptor-status.html 

7. Dunnwald LK, Rossing MA & Li CI. Hormone receptor status, tumor characteristics, and prognosis: a prospective cohort of breast cancer patients. Breast Cancer Res 9: R6 (2007). doi: 10.1186/bcr1639

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易研科技是10x Genomics的官方授权代理商，可为客户提供Chromium单细胞平台、Visium空间平台以及Xenium原位检测平台相关产品的技术讲解、仪器试剂销售及使用培训，以及相关测序数据的生物信息分析培训。

同时易研科技也提供动物解剖、组织解离、流式细胞分析与分选、质谱流式分析、蛋白多因子检测（Olink平台、Isoplexis平台、luminex平台、Ella平台）、RNA原位杂交（RNAscope平台）、多色荧光免疫组化实验、共聚焦显微成像、组织样本病理检测等全流程实验服务。

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