高通量重组蛋白表达技术在大肠杆菌中的应用

前言

在当今的生物技术领域，高通量重组蛋白表达技术在基础研究和商业应用中扮演着非常重要的角色。随着后基因组时代的到来，研究人员对大规模蛋白表达和纯化的需求日益增长，大肠杆菌因其易于遗传操作、低成本、生长迅速成为生产重组蛋白的首-选微生物宿主。本文将综述大肠杆菌中高通量重组蛋白表达的现状和未来展望，探讨从目的基因获取到蛋白表达和纯化的先进技术，并讨论如何克服重组蛋白表达过程中的挑战。

高通量重组蛋白表达技术

高通量研究是一种能够同时检测数千个生物分子，使大规模重复成为可能的研究。20世纪90年代初，第-一台DNA测序仪被开发出来，人类基因组计划随之开启，高通量技术在DNA、RNA、蛋白质、脂质和代谢物检测的需求也急剧增加。自该技术提出以来，大肠杆菌中高通量重组蛋白表达和纯化已经得到了广泛的应用。

1. 目的基因的制备

获取目的基因是重组蛋白表达的第一步。传统的方法是从cDNA文库中直接克隆基因，但这种方法存在局限性，如从库中筛选基因较为费时以及难以添加融合标签等。高通量PCR技术是目前获取目的基因Z常用的技术，设计引物并调整好参数后，即可在PCR仪中自动完成目的基因的制备。 

2. 表达载体的高通量构建

研究人员开发了多种构建表达载体的克隆方法，包括基于限制性内切酶的克隆、重组克隆和不依赖于连接反应的克隆等。这些方法各有优势和局限性，但在近年来都有显著改进。例如，基于限制性内切酶的克隆因其简单、高效、通用和成本效益而备受关注。一个理想的大肠杆菌表达载体应具备选择标记、复制起点、转录启动子、5'非翻译区（5'UTR）和翻译起始位点。此外，融合标签的添加对于目的基因的转录和蛋白表达同样至关重要。

3. 大肠杆菌表达菌株的选择和细胞培养

为保证蛋白质表达成功及其表达质量，应选择合适的大肠杆菌菌株，如BL21及其衍生菌株是较常用的重组蛋白生产菌株。培养大肠杆菌比较简单的方法是分批培养，但此方法对生长的控制比较有限。近年来，高通量培养技术使研究人员能够在一系列发酵条件下处理大量样品，大大加快了生产时间。

4. 高通量蛋白表达和纯化

高通量平台可以快速克隆基因、挑选菌落、分离质粒DNA、转化细菌、表达和纯化蛋白质。这些平台虽然成本高昂，但为复杂的分子生物学实验操作提供了极大的便利。

结论与展望

大肠杆菌中的高通量重组蛋白表达技术极大的推进了重组蛋白的表达进程。尽管存在挑战，但通过不断优化和创新，研究人员正在朝着更高效可靠的蛋白质生产系统改进。未来的发展方向包括进一步优化克隆方法、开发新的融合标签、改进表达载体和菌株，以及利用高通量技术实现从DNA到大规模蛋白质生产的快速转变等。

参考文献：

Jia B, Jeon CO. High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives. Open Biol. 2016;6(8):160196. doi:10.1098/rsob.160196