多重免疫荧光染色步骤和原理

多重荧光免疫组化技术 (Multiplex immunohistochemical，mIHC) 也称作酪氨酸信号放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技术，是一类利用辣根过氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。

这一技术基于酪胺信号的放大效应，实现对单个细胞或组织样本上多个目标靶点的同时检测。这为全面研究细胞组成、细胞功能以及细胞间的相互作用提供了强大的工具。通过多重荧光免疫组化技术，科学家们可以更深入地了解细胞的奥秘，揭示生命现象的复杂性。

mIHC 实验原理及流程

TSA 技术采用 HRP 标记的二抗，HRP 催化加入体系的 TSA 衍生荧光染料，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

原理：带有染料标记的底物酪胺 (T) 分子在过氧化氢氧化环境下，被抗体或探针固定的 HRP 转化为具有短暂活性的中间状态 (T*)，然后被激活的中间态分子 (T*) 迅速与相接蛋白分子的富含电子区域 (酪氨酸残基) 进行稳定的共价结合，未被标记的酪胺分子将被洗脱，借此实现对抗原的特异性染色。由于相接的蛋白 (包括 HRP，抗体，目标抗原) 都含有大量的酪氨酸结合位点，所以目标抗原处会富集大量标记分子，使信号被有效放大 。

多重免疫荧光染色的步骤包括样品制备、抗原诱导、抗原解露等。具体如下：

①样品制备：根据细胞或组织的不同，选择不同的处理方式。对于细胞样品，需要固定和渗透化处理以保持其形状和蛋白质结构。对于组织样品，需要切片并进行染色前的去脂处理。

②抗原诱导：如果目标标记物是蛋白质，那么需要选择适当的抗体来识别目标蛋白质。抗体可以人工合成或从动物体内提取。

③抗原解露：对于细胞样品，可以利用活液解离细胞，并将细胞固定在载玻片上。

 IHC 与 mIHC区别与联系

免疫组化，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性的研究。

简单来说，mIHC 属于 IHC 的升级版本！

Tips：

相同点：

能够完整显现组织原位形态信息。

不同点：

1. 常规免疫组化的分析属于定性分析，其判断大多依赖于经验，其分析结果会有差异。而多重荧光免疫组化属于定量分析，其利用软件可对组织中的细胞进行精-准的结果分析。

2. 常规免疫组化受传统染色成像的限制，靶标少于 3 个，无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现多因子共定位，可以获取更多的生物信息，且样本需求量较少。

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