酵母双杂交技术及其应用

       蛋白质-蛋白质相互作用在细胞信号传导、代谢控制、基因调控等生物学过程中起着关键作用。酵母双杂交技术利用酵母杂交系统提供了一种在活细胞内检测蛋白质相互作用的方法。自1990年代以来，该技术已成为揭示蛋白质相互作用网络的重要工具。

         酵母双杂交技术基于真核转录因子的模块化特性。通常，转录因子由DNA结合结构域（DNA-binding domain, BD）和转录激活结构域（Activation domain, AD）组成。Y2H技术将目标蛋白分为诱饵蛋白（bait）和猎物蛋白（prey），分别与BD和AD融合。当诱饵和猎物蛋白之间存在相互作用时，AD和BD相接触，激活报告基因的转录，从而指示蛋白质间的相互作用。

酵母双杂建库与酵母双杂筛库

酵母双杂建库

       酵母双杂建库是Y2H实验的关键步骤之一。建库的目的是构建一个表达猎物蛋白的cDNA文库，通常来自特定组织或细胞类型的mRNA。通过反转录合成cDNA，并将其克隆到带有AD的载体中，创建的酵母双杂建库用于表达多种猎物蛋白，以筛选潜在的相互作用伴侣。高质量的酵母双杂建库应涵盖目标生物体内的大部分转录本，以确保全面的蛋白质相互作用检测。

酵母双杂筛库

       酵母双杂筛库是Y2H实验中的另一个关键步骤。筛库的目的是通过在诱饵表达酵母细胞中引入猎物表达文库来筛选出与诱饵蛋白发生相互作用的猎物蛋白。酵母双杂筛库的筛选过程依赖于选择性培养基中的报告基因表达，例如组氨酸合成基因或β-半乳糖苷酶基因，通过这些基因的表达，能够在选择性培养基上检测出阳性克隆。

酵母杂交系统的操作流程

1. 诱饵蛋白表达构建：将感兴趣的诱饵蛋白序列与BD融合，克隆到适当的酵母表达载体中。

2. 酵母双杂建库：将从特定组织或细胞类型中提取的mRNA反转录为cDNA，并克隆到带有AD的表达载体中，生成猎物蛋白表达文库。

3. 共转化和筛选：将诱饵表达载体和猎物表达文库共同转入酵母细胞中，并在含有选择性培养基的平板上培养。阳性克隆的形成表明诱饵蛋白和猎物蛋白之间的相互作用。

4. 验证与分析：对阳性克隆进行分析，包括重克隆、序列验证和其他生物化学实验（如共沉淀实验），以确认蛋白质相互作用的真实性。

酵母杂交系统的应用

酵母杂交系统在多种生物学研究中得到了广泛应用：

- 蛋白质相互作用网络研究：通过酵母双杂筛库，可以揭示细胞中复杂的蛋白质相互作用网络，提供关于细胞功能的新见解。

- 信号传导通路的研究：酵母杂交系统被广泛应用于信号传导通路的研究，尤其是在识别参与信号传导的蛋白质和它们的相互作用伙伴方面。

- 疾病机制的探索：酵母双杂建库和筛库已用于研究癌症、神经退行性疾病和传染性疾病中的蛋白质相互作用，有助于发现新的靶点。

       酵母双杂交技术利用酵母杂交系统，为在细胞环境中研究蛋白质相互作用提供了强有力的工具。通过构建和筛选高质量的酵母双杂建库，研究人员能够系统地探测蛋白质相互作用，为理解生物学过程和疾病机制奠定基础。

参考文献

1. Fields, S., & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340(6230), 245-246.

2. Bartel, P. L., Chien, C. T., Sternglanz, R., & Fields, S. (1993). Using the two-hybrid system to detect protein-protein interactions. Cell, 74(1), 73-82.

3. Vidal, M., & Legrain, P. (1999). Yeast forward and reverse ‘n’-hybrid systems. Nucleic Acids Research, 27(4), 919-929.

4. Ito, T., Chiba, T., Ozawa, R., Yoshida, M., Hattori, M., & Sakaki, Y. (2001). A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(8), 4569-4574.

5. James, P., Halladay, J., & Craig, E. A. (1996). Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics, 144(4), 1425-1436.