抗体亲和力检测（BLI）

生物膜干涉技术（Biolayer Interferometry，BLI）即一种通过检测干涉光谱的位移变化来检测传感器表面反应的技术；当一束可见光从光谱仪射出后，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱。任何由于分子结合或解离而形成的膜层厚度和密度变化，能够通过干涉光谱的位移值而体现，并通过这个位移值做出实时的反应监测图谱。

BLI技术可检测蛋白质、核酸、多糖、脂类、小分子药物、抗体、病毒、细菌及细胞等各类样品，已经广泛应用于蛋白结构靶点分析、药物研发与筛选、免疫学、基因调控、信号通路、遗传学、微生物组学、病毒学、纳米颗粒、脂质体、中药提取物及天然产物分析等生命科学研究领域，并且赢得了用户的广泛认可。

一．BLI技术原理

光在同质光源中传播时，如传播距离不一致就会产生光程差（a）,光程差导致光的干涉，不同波长光线的干涉形成干涉谱（b）。生物分子在生物传感器（biosensor）表面的结合或解离会导致传感器末端膜层厚度的变化，从而导致干涉光谱的改变（c）。通过实时检测干涉光谱的位移量（Δλ），可以计算结合和解离速率，并且Z终得到相应的浓度变化。BLI技术不需要标记其他生物分子，直接对两个生物分子之间进行实时的相互作用的检测，Z大程度保证实验真实性。

图1 BLI技术原理

二．BLI检测方法

2.1动力学试验

生物分子相互作用分析系统可以实时的检测生物分子之间的相互作用，而被广泛的用于蛋白质、核酸和其他生物分子的动力学常数的测定。它可提供包括结合速率常数（Ka）、解离速率常数（Kd）和亲和力常数（KD）在内的可靠的动力学信息。动力学实验的步骤主要包括生物传感器的选择、固化（loading）、封闭（quench）、基线（baseline）、结合（association）、解离（dissociation）、再生和中和。

2.2生物传感器的选择

动力学常数测定实验常用的生物传感器主要包括SA、SSA、AR2G、APS、AHC和AMC等，每种生物传感器适用不同的生物样品，不同生物传感器使用要求也不同。如SSA仅适用于检测小分子样品；而SA用于固化生物素化的蛋白、抗体、化合物和核酸等以检测与之相互作用的大分子样品；AHC则可以直接固化人抗后检测与之相互作用的分子。

2.3固化和封闭

样品固化的好坏直接影响检测的结果，选择不同生物传感器时，其固化的方式和条件也有所不同。例如，DNA或者多肽通常先对其进行生物素化后用SA进行固化；纳米材料和脂质体用APS进行疏水固化；多糖用氨基偶联固化在AR2G上或者生物素化后用SA进行固化。另外，不同生物传感器对固化条件的要求也不同：SA需要将样品生物素化后才能固化；AR2G对固化的pH非常敏感，所用固化缓冲液中不能含有其他任何带有氨基的保护剂；APS固化物质的缓冲液中不得含有任何去污剂。生物传感器的固化浓度依据传感器种类而不同。

2.4结合和解离

为了获得准确的动力学常数，实验中平衡、结合和解离用的缓冲液必须一致。如果要比较不同条件下的解离情况，可以考虑将解离步骤在不同的缓冲液中进行。在不知道KD值的情况下，建议在筛选前采用一个相对高浓度的样品或阳性对照，先测定相互作用的有无，如果两样品间存在相互作用，再进行两轮筛选。

三．抗原抗体亲和力测定过程

第一步为biosersor浸入缓冲液中进行平衡；第二步浸入已知浓度的固化溶液中，溶液中生物素化的抗原结合到biosersor表面，使其表面膜层厚度增加；第三步将固化完已知浓度抗原的biosersor浸入缓冲液中做基线；第四步将固化好已知浓度抗原的biosersor浸入含有待测抗体的样品溶液中，由于抗原-抗体间特异性结合而导致膜层厚度的增加；第五步将已结合待测抗体的biosersor浸入缓冲液中进行解离，待测抗体从biosersor表面脱落导致膜层厚度的减少。通过对实验过程中biosersor生物膜层厚度的实时监控可以得到待测样品的动力学常数。

图2 检测过程线性图

四．BLI的主要应用

蛋白与蛋白的相互作用：（1）对蛋白质相互作用进行亲和力、动力学的全面分析，在蛋白质组学中研究蛋白的功能、信号传导和信号通路等；（2）抗体的筛选：由于生物膜干涉技术具有的快速、无标记实时检测的特点，其得到的动力学数据可以应用于抗体库中抗体的筛选或是多克隆抗体的表位作图，尤其是针对那些低亲和力或是解离非常快的一些抗体；（3）小分子化合物的筛选：可以快速、准确的筛选与靶蛋白相互作用的小分子药物；（4）抗体和小分子药物的亲和力和动力学测定；（5）核酸与蛋白的相互作用分析；（6）病毒颗粒与蛋白的相互作用。

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