杂交瘤基因测序流程

1.什么是杂交瘤测序

杂交瘤细胞抗体基因测序是指使用专业的兼并引物设计（degenerate primer）和测序方案，同时优化经济成本和时间成本，为客户提供快速准确的抗体可变区域以及全长基因测序服务。

图1：杂交瘤测序

2.杂交瘤测序目的

杂交瘤细胞在保存过程中存在抗体基因丢失、细胞状态不好影响抗体产生，甚至细胞死亡的情况，为将优秀抗体长期保存、稳定生产，可将杂交瘤细胞中的抗体基因提取并测序，拿到核苷酸序列，并以 DNA 形式保存，用于后期外源表达及生产。
3.杂交瘤测序应用

杂交瘤细胞抗体测序所获取的杂交瘤细胞单克隆抗体基因序列，是发表文章或专利必须信息和重组表达工程抗体的前提之一，同时也是抗体人源化工作的基础。

4.泰克生物能够为客户提供高质量的杂交瘤测序服务

标准周期单克隆抗体测序服务：抗体可变区VH和VL测序、抗体VH，VL和前导区测序、全抗体VH，VL，前导区和恒定区测序，3-4周完成测序服务。

快速单克隆抗体测序服务：从目标细胞株快速识别的抗体序列，可在10天内获得测序结果。

5.泰克生物为客户提供杂交瘤测序服务的全流程介绍

泰克生物为客户提供杂交瘤测序服务，流程包括：RNA提取，cDNA克隆，T载体构建，抗体基因测序，生物信息学分析，项目报告。

图2：杂交瘤测序流程

5.1杂交瘤生产和总RNA提取

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂从杂交瘤细胞中提取总RNA。

5.2反转录合成抗体可变区cDNA

5.2.1反转录

使用逆转录酶试剂盒，另外使用的是RNA样本（来自小鼠抗体的杂交瘤RNA样本或来自嵌合抗体RNA样本）、引物、10 mM脱氧核苷酸三磷酸混合物（dNTPs)、H2O和80U/μLRNAse抑制剂。注意：由于其RNA含量，将模板转换寡核苷酸分装并储存在–80℃。

根据以下方案执行逆转录：在操作期间将所有反应保持在冰上。对于每个RNA样品，设置三个cDNA合成反应：一个用于kappa链，一个用于lambda链，一个用于重链。理想情况下，每个抗体只会扩增一条轻链。

图3：3H4 kappa 和 3H4 lambda 可变区的蛋白质序列比较

5.2.1.1 在PCR管中，准备Mix 1：2μL 50ng/μL RNA、1μL 10μM基于抗体链的反向RT引物（例如用于小鼠抗体的mIGKRT、mIGLRT或mIGHGRT）和1μL 10mM dNTP。对于一个RNA样本，需要三管Mix1，每管包含不同的反向引物。

5.2.1.2 在0.5mL Eppendorf管中，配制Mix 2：1.95μL H2O、2μL 5x SMARTScribe缓冲液、1μL 20mM DTT和0.3μL 100μM模板转换寡核苷酸。为Mix2提供的体积用于一个cDNA合成反应，因此根据需要进行放大，即每个杂交瘤RNA样品制备Mix 2体积的三倍。为所有反应准备了Mix 2的一种主混合物。

5.2.1.3 通过在热循环仪中将含有Mix 1的试管在72℃下孵育3分钟，使RNA二级结构变性。

5.2.1.4在Mix 1变性期间，将以下物质添加到Mix 2：每个cDNA合成反应0.25μL 80U/μL RNAse抑制剂和0.5μL 100U/μL SMARTScribe逆转录酶。

5.2.1.5 将6μL Mix 2添加到每管变性Mix 1中。

5.2.1.6在热循环仪中，合并的混合物在42℃下孵育60分钟，然后在70℃下孵育5分钟终止反应。反应保持在4℃。逆转录后立即进行PCR扩增。不需要cDNA纯化步骤。

5.2.2 抗体可变区的PCR扩增

5.2.2.1为每个cDNA合成设置PCR反应：10μL 5x PCR缓冲液，1μL 10mM dNTPs，3μL RT反应合成的cDNA，2.5μL 10μM通用正向引物ISPCR，2.5μL 10μM反向PCR引物在抗体链上（例如小鼠抗体的mIGKPCR、mIGLPCR或mIGHGPCR）、30.5μL H2O和0.5μL 2U/μL Phusion聚合酶（或其他高保真聚合酶）。

5.2.2.2根据以下热循环仪条件进行降压/降压PCR：98℃ 30秒；98℃ 15秒、63–57.5℃ 30秒（每个循环降低温度0.5℃）和72℃ 30秒的10个循环；98℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒15个循环；随后72℃ 7分钟；并保持在4℃。

5.2.2.3每个RT-PCR反应取5μL在90V的TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上运行。扩增的小鼠抗体产物出现在550-600个碱基对之间。扩增的人抗体产物出现在750-850个碱基对之间。Quick Load Purple 2-Log DNA Ladder(NEB,N0550S)用作标准品。

图4：抗体可变区PCR扩增

5.3 T载体构建

使用Macherey-Nagel的PCR清理和凝胶提取试剂盒对RT-PCR反应进行PCR清理。根据平末端克隆试剂盒手册，将2μL的每个PCR清洗的产物平末端克隆到pCR-Blunt-II-TOPO载体中。接下来，将每个TOPO克隆反应的3μL转化为化学感受态E.Coli。将每个转化的100μL涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃下孵育过夜。

5.4 抗体基因测序

获得菌落后，将每条抗体链5-10个菌落接种在5mL LB/卡那霉素培养基中，并在37℃下以250rpm摇动过夜。这些培养物使用Macherey-Nagel的小量制备试剂盒进行小量制备，所得质粒DNA由Sequetech Corporation使用M13正向引物进行Sanger测序。

5.5生物信息学分析

使用 GitHub 上提供的自定义 Python 程序分析测序数据，去除非功能性的DNA。

5.6项目报告

交付得到的抗体序列。

杂交瘤细胞单抗基因序列的获取是进行重组抗体制备，抗体药开发的基础。泰克生物能够准确熟练地对多物种来源的杂交瘤细胞进行序列测定，服务包括小鼠杂交瘤细胞，大鼠杂交瘤细胞，兔杂交瘤细胞以及不同物种的重组单克隆抗体（通过噬菌体技术构建的单抗基因获得）等。通过严格的质量控制，以确保高准确度。