低产油菌株走开，高产油菌株快来！

2024-08-2285

在生物能源研究中，利用微生物开发新型油脂资源是一个重要方向。过去对于产油微生物的检测定量通常具有破坏性，不利于后续研究^[1]。采用P300 共聚焦拉曼光谱仪对低产油酵母（酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae）以及高产油酵母（皮状丝孢酵母，Trichosporn cutaneum AS2.571，CGMCC）进行研究。研究中，P300共聚焦拉曼光谱仪表现出了出色的产油微生物（皮状丝孢酵母）检测能力，并能够半定量皮状丝孢酵母中饱和/不饱和脂质的产量。同时，拉曼光谱的不同峰位能够反映不同的脂质类型，即P300共聚焦拉曼光谱仪能够实现产油微生物的无创脂质类型鉴定与相对定量，在功能微生物和细胞生物学的研究中有很好地应用潜力。

研究方法

选择低产油酵母（酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae）以及高产油酵母（皮状丝孢酵母，Trichosporn cutaneum AS2.571，CGMCC）进行实验。前者菌体油脂含量在10-30%（w/w）之间^[2,3]，后者则高达65%（w/w）^[4]。

考虑到酵母产油受碳/氮比（C/N）、生长阶段影响，且在平台期具有高浓度的脂类堆积。参照文章方法^[4]，培养得到不同时间点（8h和120h）样品并进行确认。

实验流程图

1. 荧光检测

参考K.A Rostron等的方法^[3,5]进行样品制备。采用PRECI SCS-F可视化荧光单细胞分选仪检测。

2. 拉曼成像

采用HOOKE P300共聚焦拉曼光谱仪检测。每个样品选择3-10个酵母的视野进行拉曼成像（Mapping）。

3. 拉曼结果分析

拉曼成像的光谱数据导入HOOKE IntP线下分析软件进行前处理，包括去宇宙射线、滤波、去背景、归一化等过程。接着利用该软件计算信噪比，筛选信噪比>2的光谱视为有效光谱。

拉曼光谱中饱和脂类（CH以及CH2振动）的相对波数为1420-1480cm^-1区域，不饱和脂类（C=C振动）的相对波数为1650-1670cm^-1区域^[6,7]。结合样品的指纹区拉曼光谱，选择了1450cm^-1以及1656cm^-1峰位进行比较。以相对波数1002cm^-1处（C-C芳香环伸缩振动、苯丙氨酸）的峰强作为内参，对1450cm^-1以及1656cm^-1的峰强进行相对定量。统计比较两个时间点脂类含量。

研究结果

通过比较8h和120h两个时间点1450cm^-1以及1656cm^-1峰的相对强度，可以发现饱和脂类含量随时间增加显著升高（约1.24倍），这一结果与之前的研究中，限氮条件下酿酒酵母在生长的平台期后期持续积累脂类的结论一致。

Fig1. 酿酒酵母荧光以及拉曼光谱。

酿酒酵母8 h以及120 h时间点样品的荧光结果A) ；样品均值拉曼光谱B)；样品荧光强度统计C)；拉曼光谱1450 cm^-1处的相对强度 D)；拉曼光谱1656 cm^-1峰位处的相对强度E)

对于高产油皮状丝孢酵母的脂质积累情况，荧光强度比较发现同时间点其脂类积累水平较酿酒酵母更高。然而，皮状丝孢酵母样品内存在低积累的酵母个体，结果浮动大。在这一异质性情况下，比较皮状丝孢酵母与酿酒酵母在1450cm^-1峰位拉曼光谱的平均值发现，前者的相对峰强较后者提高了1.44倍。

对不同时间的高产油皮状丝孢酵母拉曼光谱进行比较发现，对于一些脂质累积水平较高的酵母个体而言，其48h时 1450cm^-1的相对峰强为8h时平均峰强的2-4倍。即使是两个时间段的平均相对峰强进行比较，1450cm^-1与1656 cm^-1位置处的相对峰强都随时间的增长而增强。

Fig2. 皮状丝孢酵母荧光以及拉曼结果。

皮状丝孢酵母8 h以及48 h时间点样品的荧光结果A) ；样品均值拉曼光谱B)；样品荧光强度统计C)；拉曼光谱1450 cm^-1处的相对强度 D)；拉曼光谱1656 cm^-1处的相对强度E)

结论

本应用利用拉曼光谱方法对酵母的油脂积累情况进行评价，其结果与荧光结果一致。拉曼光谱方法可以简便快速的在单细胞层面评价微生物油脂含量，且这种采集方式是非破坏的。拉曼光谱不仅能够进行半定量分析，也具有区分不同类型油脂（脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、磷脂等）以及油脂不饱和情况（单不饱和、多不饱和）的潜力^[7]。同理，拉曼光谱也具备对多糖、蛋白等进行分析与半定量的潜力。

应用优势

过去对于产油微生物的检测定量通常是具有破坏性的，这类传统的破坏性检测方法不利于后续产油微生物的下游研究，而P300共聚焦拉曼光谱仪在该应用中表现出了出色的产油微生物（皮状丝孢酵母）检测能力，并能够半定量皮状丝孢酵母中饱和/不饱和脂质的产量。同时，拉曼光谱的不同峰位能够反映不同的脂质类型，即P300共聚焦拉曼光谱仪能够实现产油微生物的无创脂质类型鉴定与相对定量，在功能微生物和细胞生物学的研究中有很好地应用潜力。

同时，在本应用中，除了通过拉曼检测对产油微生物进行了鉴定外，也通过对脂质的荧光染色进行了对照验证，这一过程采用的仪器也是的PRECI SCS-F可视化荧光单细胞分选仪，该仪器除了能够对不同激发光波段的荧光样品进行成像外，还能直接进行多荧光通道共同成像，并根据荧光进行单细胞分选，实现真正意义上的“所见即所得”。

参考文献：

[1] Patel, A., Antonopoulou, I., Enman, J., Rova, U., Christakopoulos, P., and Matsakas, L. (2019) Lipids detection and quantification in oleaginous microorganisms: an overview of the current state of the art. BMC Chemical Engineering. 1, 13

[2] Miranda, C., Bettencourt, S., Pozdniakova, T., Pereira, J., Sampaio, P., Franco-Duarte, R., and Pais, C. (2020) Modified high-throughput Nile red fluorescence assay for the rapid screening of oleaginous yeasts using acetic acid as carbon source. BMC Microbiol. 20, 60

[3] Rostron, K. A., Rolph, C. E., and Lawrence, C. L. (2015) Nile red fluorescence screening facilitating neutral lipid phenotype determination in budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Antonie van Leeuwenhoek. 108, 97–106

[4] 李永红刘波 (2005) 广谱碳源产油酵母菌的筛选. 中国生物工程杂志. 25, 39–44

[5] Rumin, J., Bonnefond, H., Saint-Jean, B., Rouxel, C., Sciandra, A., Bernard, O., Cadoret, J.-P., and Bougaran, G. (2015) The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnol Biofuels. 8, 42

[6] Movasaghi, Z., Rehman, S., and Rehman, I. U. (2007) Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493–541

[7] Czamara, K., Majzner, K., Pacia, M. Z., Kochan, K., Kaczor, A., and Baranska, M. (2015) Raman spectroscopy of lipids: a review. Journal of Raman Spectroscopy. 46, 4–20

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